TALENS技术.ppt

* TALENs 小组成员：宋海林 王钦 余文凡 邓林炜 朱翔 12级生技本一 TALENs的靶向基因修饰技术 TALENs--transcription activator-like effectors nucleases 《科学》杂志：2012年度10大科学突破 基因组的精密工程TALENs 通 常，人们无法确定对高级生物的DNA进行修改和删除的最终结果。然而，在2012年，名为“转录激活子样效应因子核酸酶”（TALENs）的工具赋予研究 人员改变或关闭斑马鱼、蟾蜍、牲畜及其他动物甚至病人的细胞中特定基因的能力。这种技术以及其他新兴的技术与已有的基因靶向技术一样廉价和有效，同时它能 让研究人员在健康人和病人中确认基因及变异的特定作用。 研究发展历程 最早关于TALE蛋白的研究始于AvrBs3，其特异识别DNA碱基的特性直到2009年才首次得到应用。该应用研究发表在Science杂志上。同年人们彻底搞清了talen识别规则，并且在随后的2014年CELL杂志上发表了其特异识别的原理。自TALE序列被完全解译以后，其应用逐渐普及开来。 自TALEN技术正式发明以来，TALEN的特异性切割活性在酵母、拟南芥、水稻、果蝇及斑马鱼等多个动植物体系和体外培养细胞中得以验证。2013年，首尔国立大学化学系和国家基因工程创新举措研究中心的Kim课题组建立了一个全基因组规模的TALEN体系。他们系统地选取了人类基因组中高度特异性的序列作为靶点以避开脱靶效应。通过高通量克隆体系，一次性构建了近2万个编码蛋白基因的TALEN质粒。这项研究中，他们以一种巧妙的方式优化了TALEN质粒的结构，以检测插入靶点后质粒对应位置上eGFP的表达的方式检测TALEN靶点插入成功率。通过研究不同间隔序列下特定靶点插入效率，从而得出最佳TALEN体系结构。 2014年2月，北京大学生命科学学院魏文胜课题组依托于一种自主研发的TALE蛋白组装技术完成了全部TALE元件的解码工作。 2010年至今，TALEN技术已被全球范围内各实验室使用。服务公司更如雨后春笋般大量涌现，如GeneCopoeia等。 那什么是talens呢？ TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。 TALENs充分利用植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白---即激活因子样效应物(TAL effectors, TALEs)---的功能:该蛋白能够识别特异性DNA碱基对。人们可以设计一串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列，如果再附加一个在特定位点切断DNA双链的核酸酶，就可以构建出TALEN，利用这种TALEN就可以在细胞基因组中引入新的遗传物质。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。 talens原理 TALENs技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。  2. TALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。实验设计 简单准确、实验周期短、成本低。 3. 成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶情况少。 4. 克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性。 应用 TALENs 作用机制 结构及其构建 TALE蛋白的DNA结合结合域 Fok I 核酸酶的切割结构域 TALENs结构 TALE靶点识别模块构建 TALE蛋白是由黄单胞菌进入植物细胞分泌的,能识别并结合特异的 DNA 序列， Fok I（剪切结构域） 则可通过二聚化产生核酸内切酶活性, 在该序列附近造成 DNA 的双链断裂(Double-stand break, DSB)。 TALE靶点识别模块构建 TALE是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基 (RVDs)位