转化子的筛选与重组子的鉴定绪论.pptVIP

转化子的筛选与重组子的鉴定 为什么要进行转化子的筛选和重组子的鉴定？ 在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，因此必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、期望重组子与非期望重组子。 转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 期望重组子：含有目的基因的重组子。 非期望重组子：不含目的基因的重组子。 三者的关系 转化子的筛选与重组子的鉴定方法 基于载体遗传标记的筛选与鉴定 　　利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 　　由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有广泛的实用性 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 　　如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子 噬菌斑筛选法 PCR鉴定法 PCR技术的两大主要用途为目的基因的获得和DNA特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，PCR技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的基因或DNA片段是否整合在受体细胞的基因组上。上述PCR鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落分别挑出进一步培养，因此不太适用于成千上万个转化子的鉴定。 菌落原位杂交法 菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）能从成千上万个转化子中迅速检测出期望重组子，其前提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探针序列。根据核酸杂交原理，探针序列特异性的杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位检测。 原位杂交的操作程序 探针的制备 　　探针的长度以及与目的基因之间的序列同源性是杂交实验成败的关键 　　最佳的探针长度范围为100~1000bp 　　探针内部不能含有大面积的互补序列，会直接影响探针与DNA靶序列的杂交。 探针的获取方法： 　　1、目的基因的同源序列 　　2、cDNA 　　3、人工合成 探针的标记 　　探针在杂交后是通过其分子中的放射性同位素或荧光基团进行定位 示踪的，放射性的强弱直接关系到杂交反应的灵敏度。 　　单位长度探针标记的同位素越多，杂交反应灵敏度就越高。 探针标记方法： 　　1、5＇端标记法。 　　2、反转录标记法。 　　3、缺刻前移标记。 　　4、ABC标记法。 5＇端标记法 缺刻前移标记法 蛋白质生物功能检测法 放射免疫原位检测法 基本原理及操作程序与菌落原位杂交法非常相似，只不过后者是用核酸探针通过碱基互补的形式特异性杂交目的DNA序列，而前者利用抗体通过特异性免疫反应搜寻目标蛋白质。因此使用放射免疫原位检测法筛选鉴定期望重组子的前提条件是外源基因在受体细胞中必须表达出具有正确空间构象的蛋白产物，同时具备与之对应的特异性抗体。 蛋白凝胶电泳检测法 　　　对于那些生物功能难以检测的外源基因编码产物，手头又没有现成的抗体做蛋白免疫原位分析实验，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对重组克隆进行筛选鉴定。 双脱氧末端终止测序法的基本反应： Klenow OH 3 5 P T dNTP + ddATP T T T T T OH 3 5 P A G T C GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 蛋白质生物功能检测法 放射免疫原位检测法 蛋白凝胶电泳检测法 　　某些外源基因编码具有特殊生物功能的酶类或活性蛋白（如α-淀粉酶、葡聚糖内切酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、抗生素抗性蛋白等），设计简单灵敏的平板模型，可以迅速筛选出克隆了上述蛋白编码基因的期望重组子。 重组子 利用淀粉酶基因表达产物检测重组子 * LOGO 转化子 重组子 期望重组子 基于载体遗传标记的筛选与鉴定 抗药性筛选法 营养缺陷性筛选法 显色模板筛选法 噬菌斑筛选法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pBR322 4363 bp ori 可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。 非重组子：Apr、Tcr 重组子：Aps、Tcs 抗药性筛选法 将外源DNA片段插入BamH I、Sal I位点 将转化液涂布含Ap的平板 Ap 再将Ap平板上的转化子影