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DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.02.002 ·论著· 红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究 【】 研究红色荧光蛋白编码基因 Dsred 在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。 方法 根据已发表基因序列设计引物，采用连续重叠 PCR 方法快速克隆获得全长 Dsred 基因，将其与 pMD-18T 载体连接后进行测序鉴定。通过 In-fusion 方法将鉴定正确的 pMD-Dsred 重组载体与酿酒酵母表达载体 pYeDP60 进行连接，测序后利用 LiAc 方法将鉴定正确的 pYeDP60-Dsred 重组表达载体转化至酿酒酵母菌 W303-1B 中，PCR 扩增筛选阳性克隆，获得的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌经诱导培养后进行 SDS电泳分析和绿光激发荧光成像检测。将工程菌分别接种至 YPD、YPG、SCG 和 SCD 培养基，培养 48、72、96、120 和 144 h 后分别测定吸光度（A600）值。取诱导表达后的工程菌（菌液组）进行离心（菌体组）、离心后加甘油（高渗组）处理，分别置于 –70、–20、4、28 和 37 ℃ 条件培养，荧光显微镜观察其表达特性。 结果 连续重叠 PCR 扩增和测序鉴定结果表明，扩增获得的 Dsred 基因长为 678 bp，其序列与已发表的基因序列完全一致；Dsred 基因已成功插入 pYeDP60-Dsred 重组表达载体，且受酵母诱导型启动子 GAL1-CYC1 调控表达。PCR 扩增筛选和 SDS分析显示，pYeDP60-Dsred 重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中，诱导表达产物相对分子质量与预期相符，且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。4 种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别，重组 Dsred 红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长。荧光显微镜观察显示，工程菌经不同处理后，高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短，菌液组时间最长；红色荧光蛋白在 37 ℃ 条件下培养时成熟最早，但降解速度较快。 结论 成功构建了 pYeDP60-Dsred 重组酿酒酵母表达载体，实现了Dsred基因在酿酒酵母菌体内的异源表达。红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响，且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。 【关键词】光蛋白；酵母酿酒；表达 中国医药生物技术, 201, 7(2):93-99 红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)是从珊瑚纲生物中分离出来的一类与绿色荧光蛋白green fluorescent protein，GFP同源的荧光蛋白，其在紫外光的照射下可发射红色荧光[1]。自 1999 年首次被分离出来至今，红色荧光蛋白以其激发和发射波长较长、细胞内成像背景低、细胞毒性小而备受关注并广泛应用。迄今为止，红色荧光蛋白已经拥有多种突变体[2-10]，与最初的红色荧光蛋白相比，突变体红色荧光蛋白在成熟时间、荧光强度、发射波长以及聚集程度方面均有很大改观，同时更多成熟时间短[2-4]、荧光强度强[5-7]、发射波长更长的单体红色荧光蛋白[8-10]也得以成功开发应用。不仅如此，红色荧光蛋白性能的改善还使其更多地被用于分子标签[11-13]以及蛋白相互作用[14-16]的研究。为了更好地拓宽红色荧光蛋白的应用领域，本实验尝试将红色荧光蛋白 Dsred 基因导入酿酒酵母菌，实现红色荧光蛋白在酿酒酵母菌体内的异源表达；同时为缩短红色荧光蛋白的成熟时间，对缺水环境中红色荧光蛋白的表达特性进行了分析，以期为红色荧光蛋白更好地应用于双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complementary，BiFC）[14-16]等蛋白互作技术研究提供实验依据。 1 材料与方法 质粒与菌株 大肠杆菌菌株 E.coli TG1 和酿酒酵母菌株 W303-1B（MATaade2-1；his3-11, his3-15；leu2-3, leu2-112；ura3-1；trp1-1）均为本实验室保存；pMD18-T 载体购自宝生物工程（大2011-12-12 连）有限公司；pYeDP60 酿酒酵母表达载体为法国 Werck-Reichhart 教授馈赠。 1.1.2 试剂与仪器 KOD Plus 高保真 DNA 聚合酶购自日本 Toyobo 公司；鲑鱼精 DNA 购自日本 Wako 公司；聚乙二醇（PEG4000）购自北京欣经科生物技术有限公司；醋酸锂和伴刀豆球蛋白购自美国 Sigma 公司；酵母质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；