第6章 植物原生质体培养与体细胞杂交.ppt

第六章 植物原生质体培养与体细胞杂交 第一节 原生质体的分离和纯化 第二节 原生质体培养 第二节 植物体细胞杂交 第一节 原生质体的分离和纯化 一、植物原生质体的概念 二、原生质体的分离 三、原生质体的纯化 四、原生质体的活力测定 五、影响原生质体数量和活力的因素 一、植物原生质体的概念 1880年，Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。 原生质体(protoplast) ：去掉细胞壁的细胞或是由质膜包裹的具有生活力的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体，它可以具有细胞核或没有细胞核。 核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。 二、原生质体的分离 1.机械法分离原生质体 借助利器（如刀等）或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。 2. 酶解法分离原生质体 借助酶解液的作用降解细胞壁，获得大量有活力的原生质体的方法。 （1）材料选择 （2）材料预处理 目的：改变细胞和细胞壁的生理状态，提高酶解效率，提高原生质体的活力和分裂频率。 方法： 低温处理、 暗处理、 预培养等。 纤维素酶： 从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂。作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体 。 如： Cellulase Onozuka R-10（Japan） Cellulase Onozuka RS （Japan） Cellulysin（USA） 纤维素酶EA-867（上海植生所） 果胶酶/离析酶： 是从根霉或曲霉中提取出来的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从植物组织中单独释放出来。 如： Macerozyme R-10（Japan） Pectinase（USA） Pectolyase Y-23（Japan） 酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基 渗透压调节剂： 作用：代替细胞壁对原生质体起保护作用。 糖醇类：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 使用浓度：0.2～0.8mol/L 质膜稳定剂： 溶液中加入一些盐类，可以保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力。 常用的有：CaCl2（0.7～1.0mol/L）、KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、MES（2-氮吗啉乙烷磺酸）和葡聚糖硫酸钾等。 酶液的配制： 按已确定使用的酶和稳定剂的量称取酶和各种稳定剂,并把它们逐步溶解，配制成酶液之后，酶液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤灭菌后备用。 酶液的pH值： 分离原生质体时一般将酶液的pH调节在5～6之间。 一些作物所用的酶解液 两步法：先用果胶酶离析植物组织后收集植物细胞，洗涤后用纤维素酶解离细胞壁。 一步法：把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液,对材料进行一次性处理。 三、原生质体的纯化 纯化的含义： 一是从酶混合液中收集到的原生质体,在培养前必须把酶液冲洗干净；二是得到纯净的原生质体。 1.飘浮法 原理：利用原生质体和其他组分密度的不同，酶解处理中使用相对分子质量较大的物质（蔗糖、葡聚糖），离心后使原生质体漂浮在溶液表面，细胞碎片等杂质下沉到管底的方法。 特点：操作简单，但数量上损失较多。 2.沉淀法 原理：酶解处理中使用相对分子质量较小的物质（甘露醇），原生质体的比重大于溶液时，在低速下离心后原生质体沉到管底,其余细胞碎片等物多数漂浮在溶液中。 特点：简单方便，丢失少，但纯度不够高。 3.界面法（梯度离心法） 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，经离心后使完整无损的原生质体处于两种溶液的界面之间，而细胞碎片等杂质沉于管底，高度净化完整原生质体可在这两相系统的界面上收集到。 特点：可以收集大量、纯净的原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互积压而破碎。 常用系统：PEG（6000）-Ficoll（400000）系统， 甘露醇（182.17 ）-Ficoll系统， 蔗糖（342.3 ）-甘露醇系统等。 四、原生质体的活力测定 原生质体活力＝ 有活力原生质体数 观察原生质体数 1.形态识别：形态完整，富含细胞质，颜色新鲜，正常球形 。 2.相差显微镜观察法：观察细胞质环流、核的正常与否。 3.酚藏花红染色法（0.1%) ：有活力原生质体不被染色，而无活力的被染成红色 。 4.伊凡蓝染色法(0.025%) ：活力受损或死细胞才能摄取这种染料，活细胞