流式细胞术Annevin-V-FITCPI双染法检测脑胶质瘤-第三军医大学学报.docVIP

流式细胞术检测蓝莓提取物对脑胶质瘤细胞增殖抑制的作用 贾宇臣1赵凯2* 扈瑞平1 陈琦1 (王利1 1.内蒙古医科大学，呼和浩特市，010059 2.内蒙古呼和浩特市第一医院，呼和浩特市，010010 摘要 目的：应用流式细胞术检测蓝莓提取物对脑胶质瘤细胞的诱导凋亡及抑制细胞增殖。方法：脑胶质瘤细胞株经药物处理后，胰酶消化收集单细胞悬液，经Annevin-V-FITC/PI双标记后流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡；经PI单染后进行细胞周期分析。结果：随药物浓度增加凋亡细胞比例增多，各组间差异具有统计学意义（p=0.008，p＜0.05）；BG137细胞经药物处理后细胞S期比例改变明显，各组间差异具有统计学意义（p=0.000，p＜0.05）。结论：流式细胞术结果显示，可以明确区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞与坏死细胞，经药物处理后细胞周期阻滞在S期，抑制其进入细胞周期G2/M期相，流式细胞术是分析细胞增殖抑制作用的理想手段。 关键词：神经胶质瘤；流式细胞术；Annexin V-FITC/PI双染法；蓝莓提取物；凋亡； 中图法分类号：R-332 Inhibitory effect of blueberry extractive on priliferation of hunan glioma BG137 by flow cytometry JIA Yu-Chen ZHAO Kai Hu Ruiping Chen Qi Wang Li 1. Inner Mongolia Medical University, Hohhot, 010059,China 2.the First Hospital of Hohhot, Hohhot, 010010,China Abstrat:objective To quantify the apoptosis and cell cycle of glioma cells by flow cytometry. Methods After single-cell suspension was preparated, Cells apoptosis and cell cycle were deteacted by flow cytometry(FCM) with Annevin V-FITC and PI double-labeled method and PI single-labeied respectively. Results The ratio of apoptosis cells was significantly rised with the increasing of drug concentration. S phase proportion of glioma BG137 cells treated by blueberry extractives changed obviously, Compared with control group（p＜0.05μl）、中（200μl）、高（300μl）和对照组（等体积的培养基）四组。 1.4.3 单细胞悬液的制备 药物处理后进行Annevin V-FITC/PI染色。参照[7-8]并加以改进。细胞培养在6孔板内，当细胞接近80%左右融合度时分别加入药物100μl、200μl、300μl设置3个重复，作用18h之后， PBS洗涤1次，加入适量的0.25%胰酶消化细胞，显微镜下观察贴壁细胞变圆，移液管轻轻吹打后，加入含牛血清的完全培养基终止消化，转移至离心管，1200r/min 离心5min,收集细胞使用冷的PBS缓冲液洗细胞次，再用1× Binding Buffer缓冲液制成1×10细胞/ml的悬液。取管，阴性对照管标本管号1号管：阴性对照管，未标记荧光染料2号管：Annexin V-FITC染色3号管： PI染色4号管：样本管，Annexin V-FITC、PI荧光染料双标记加入100 μl细胞悬液加入Annexin V与核酸染料轻轻混匀，室温，避光处放置15min各管中加入1×Binding Buffer缓冲液400μlｈ内上流式细胞仪测定结果。×106细胞，PBS漂洗细胞2次，弃上清；（2）加1.2ml PBS和2.8ml预冷的无水乙醇，使其成为70%乙醇溶液，轻轻混匀，4℃固定过夜；（3）1200r/m 5min离心，弃上清，PBS漂洗2次；（4）加0.5mlPBS重悬细胞，加入10μg/μl RNase A 2.5μl(终浓度50μg/μl），37℃消化30～45min，期间振荡混匀2～3次；（5）冰浴终止消化；（5）过400目细胞筛或尼龙网，置于流式上样管中；（6）加入50μl PI（含1%Triton),混匀，室温避光5min