固相膜免疫技术总结.pptVIP

一、固相免疫测定 二、固相膜的特点 多孔性 毛细管作用 非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性 易于漂洗 操作简便 三、常用的固相膜 玻璃纤维素(fiberglass)膜 尼龙(nylon)膜 聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜 硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜 四、固相膜的技术要求 孔径：0.2~0.6μm或5~10μm 流速：以ml/cm2/min表示 蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示 均一性 五、固相微孔膜测定种类 1.斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA) 2.免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA） 3.斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 4.酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) 5.免疫印迹法(Immunoblotting Test, IBT) 6.放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 六、膜固相免疫测定的特点 一、概述 1.概念 以胶体金作为标记物的免疫检测技术 2.类型 免疫金组织化学技术 金免疫技术 金免疫测定技术 二、胶体金基本知识 1.胶体金的制备 (1)在一定浓度的金溶液内加入定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液，即胶体金（colloidalgold）,也称金溶胶（goldsol）。 (2) HAuCl4是主要原料，常用的还原剂有柠檬酸钠等。良好的胶体金应清亮透明，在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入NaN3防腐。 胶体金（Colloidal Gold）15~60 nm 三、免疫金的特性和制备 胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组化技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时，胶体金多与免疫活性物质（Ag或Ab）结合，这类结合物常称为免疫金。 免疫金（银）染色应用 多用于组织化学检测 敏感度低于其它标记免疫技术，但经银加强染色后敏感度与荧光免疫技术和酶免疫技术相当 近年来发展了不少IGSS方法以替代荧光免疫技术，可以在普通显微镜下进行检测 五、金免疫测定 斑点金免疫渗滤试验（Dot Immunogold Filtration Assay ,DIGFA） 金免疫层析试验（gold immuno－chromatography assay，GICA） 1.斑点金免疫渗滤试验（DIGFA） 原理 硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的吸附性及可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成 技术类型 双抗体夹心法 包被抗体 待检抗原 金标抗体 间接法 包被抗原 待检抗体 金标抗抗体 竞争法 包被抗原 待检抗原 金标抗体 技术要点 试剂盒组成 免疫金标记物 渗滤装置（充满吸水垫料的塑料小盒,盒盖中央的小孔下面放置一片NC膜,膜上预包被Ag或Ab斑点） 洗涤液 2.胶体金免疫层析试验 原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端横向渗移，犹如横向层析一般，层析过程中在适当部位进行抗原抗体反应 胶体金免疫层析试验 技术类型 双抗体夹心法 竞争法 间接法 ICA——间接法测抗体 IFA与ICA的比较 金免疫测定方法特点 试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条。 1.吸水材料 2.免疫金复合物干片（下），硝酸纤维素膜 （上）T：硝酸纤维素膜条包被特异抗体， R：参照区，包被有抗小鼠IgG。 金免疫测定方法评价 简便、快速、单份测定，立等结果，除试剂外无需任何仪器，且试剂稳定，适合于急诊检验，但不能定量。(point of care test,POCT)” 金免疫测定应用 1.临床应用：定性分析，主要检测正常体液中不存在的生物活性物质，以及正常情况下体液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。 （1）传染病：?病毒相应抗原、抗体；性病病原体；细菌；寄生虫。 （2）激素：?生殖标志物，如诊断早早孕HCG、检测排卵的促黄体生成