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病原学检查技术 一、细菌性传染病病原检查 1、显微镜检查法 2、培养检查法 3、生化试验 4、动物试验 皮下接种、腹腔接种、肌肉接种、静脉注射 二、病毒性传染病病原检查 1、病毒分离培养 （1）样品处理 将检疫材料制成混悬液，加入抗生素，离心取上清液 （2）鸡胚接种 （3）动物组织培养 鸡胚接种技术 鸡胚的结构 病毒的细胞培养 基本原理 通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增值。 在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上，置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变（CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反复冻融3次，置-70℃保存备用。 基本原理 细胞病变效应　　 英文名：cytopathic effect （CPE) 　　 定义：在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，经过一定时间后，可用显微镜观察到细胞变圆，坏死，从瓶壁脱落等现象，称之细胞病变作用。　 基本原理 主要有以下几种： 1.整个细胞都发生改变，有两种情况，其一是胞核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变化，胞膜边缘不整齐；其二是，整个细胞皱缩，变圆直至碎裂，脱落等，多见于肠道病毒、痘病毒、呼吸病毒、鼻病毒、科萨奇病毒；2.细胞发生聚合，如腺病毒；3.细胞融合形成合胞体，即多数细胞发生相互融合而成“巨细胞”，但各个细胞核仍然能分辨清楚，如副粘病毒、疱疹病毒；4.细胞仅产生轻微病变，如正粘病毒、狂犬病毒、冠状病毒、逆转录病毒以及沙粒病毒。 细胞培养的基本概念 传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 原代细胞培养 概念：从供体获取组织细胞后在体外进行的首次培养。 优点：生物学特性未发生很大变化，细胞染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒学方面的实验 缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。 传代细胞培养 概念：原代细胞经过一系列传代，产生变异，转化为能够连续传代的细胞。 传代细胞可以直接从肿瘤组织获得，又可以通过人工驯化获得。 常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等 培养实验用品的前期处理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿 2.包装 3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。 4.细胞培养用液及培养基（液）: （1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。 （3）消化液 : 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左右。需过滤除菌。 EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。 (4) 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 细胞培养的实验步骤 1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例 （1）取胚 （2）组织处理 （3）消化 （4）分装、培养 （1）取胚 选取9-11日龄SPF鸡胚，大头朝上直立于蛋架上，用碘酒、酒精消毒气室外壳。用镊子从气室端打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌平皿中。 （2）组织处理 用PBS液冲洗胚体2-3次，再将鸡胚的头、爪、内脏去除，剩下的胚体在用PBS液冲洗胚体2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀将鸡胚剪成碎块。 （3）消化 用PBS液充分冲洗组织碎块2-3次，加入3-5倍量的胰蛋白酶消化液，置37℃消化10分钟，每隔2-3分钟轻轻摇动一次。待组织碎块聚合成团，边缘毛样模糊时取出，轻轻吸取上层消化液，加适量DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细