甲胎蛋白基因的检测.pptxVIP

甲胎蛋白基因的检测 outline 实验目的 目的：通过提取肝癌病人的外周血，根据mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测。 取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者与非癌性肝病患者作为对照组。 实验方法及原理 通过细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成cDNA，利用qPCR技术，测定AFPmRNA的丰度。 实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。 Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过内参或者外参法可对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。 技术路线 RNA提取 用TRIzol试剂盒提取RNA TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。 RNA提取 1.细胞或组织加 Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。 2.12,000rpm离心5min，弃沉淀。 3.按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。 4.4℃12,000rpm离心15min。 5.吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。 带手套是必须的，手是RNase的主要来源！ RNA提取 6.按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。 7.4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。 8.按1ml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 9.4℃ 8,000rpm离心5min，尽量弃上清。 10.室温晾干或真空干燥5-10min。RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。 11.可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。 RNA提取 12.将提取的RNA于紫外分光光度计上定量测OD值定量RNA浓度 注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间（组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染） 13.于0.8%琼脂糖凝胶电泳以明确RNA未降解。 cDNA合成 cDNA合成使用Promega逆转录试剂盒 反应管中加入1ug总RNA和0.5ug oligodT,70℃预变性5min,迅速置冰上冷却 加入5×RTbuffer[250mM Tris-HCL(PH8.3),375mM KCl,15mM MgCl2,50mM DTT]4ul,10mM dNT1ul,RNA酶抑制剂25U,M-MLV逆转录酶200U,加0.1%DEPC水至总体积20ul,37℃水浴60min 95℃3min灭活逆转录酶,-20℃冻存备用。 RT-PCR 上游引物序列: 5’--TGGGACCCGAACTTTCCAAG--3’ 下游引物序列: 5‘--CCTGCAGACAATCCAGCACAT--3’ 探针序列： 5’--TGTCCCTCTTCAGCAAAGCAGACT--3’ RT-PCR 50ul PCR反应体系中,包括5×PCR buffer 10ul,AFP上下游引物各16pmol,荧光探针10pmol,Tag酶3U,10mM dNTP1ul,cDNA 5ul 在ABIPRISM7700型PCR仪(美国PE公司)进行扩增。 反应条件:93℃预变性2min,93℃45s,55℃120s,共40个循环。反应结束后由计算机自动得出每ug总RNA中AFP mRNA的拷贝数。 统计学处理 统计学处理进行t检验,以p0.05为显著统计学差异。 可能的结果分析 肝癌患者与对照组的外周血中AFPmRNA的表达水平有显著差异。 应用 AFPmRNA由有活性的肝癌细胞表达,坏死后脱落入血的肝癌细胞不可能有mRNA的表达,即使肝脏癌组织直接释放少量裸露的AFPmRNA,也会被血液中丰富的RNA酶所迅速降解,外周血中检出AFPmRNA即提示血循环中存在活动的肝癌细胞。 检测肝癌细胞的扩散水平，辅助影像学和病理学检查。 参考文献 [1]NIEChang-fu,WANGJian-Guo,YANGRui-min.The Detection of AFP mRNA expression in PeriPheral Blood of Patien