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人类基因组DNA提取 Contents 人类基因组DNA提取 人类基因组DNA提取 实验原理 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。 一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。 人类基因组DNA提取 实验步骤 5.?小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。? 电泳鉴定 ?取样品1μl、电泳缓冲液5μl、6×加样缓冲液1μl（含溴酚蓝和二甲苯青FF指示剂及甘油），混匀，在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体λDNA作为标准。DNA区带应比较集中，泳动速度与λDNA相同或稍慢，证明分子量均?50kb。一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的RNA区带。如果DNA不成区带，而是散开分布在λDNA与溴酚蓝之间，则说明DNA已经被降解成小分子，不能再用来进行限制性内切酶图谱分析。 五、?注意事项 ?1.?酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋白质分开时，可加入适量STE稀释，然后再用酚抽提。 ?2.?保温可在45~55℃范围内进行。? 3.?真核生物的DNA分子很大，机械张力极易引起DNA分子的断裂，因此抽提DNA时动作不可过猛；溶液转移次数要尽量减少，而且转移时一定要用粗口径滴管，?以防机械力（震动）将DNA分子打得太碎。 ?4.?沉淀DNA时要小心操作，勿使纤维网断成小丝。 ?5.?DNA溶于TE溶液时可先浓一点，发现太浓时再加些TE溶液。这样能保证DNA样品不至于太稀而无法使用，一般来讲，DNA浓度为0.4~0.6mg/ml最为理想。 ?6.?溶于TE溶液中的DNA样品比较稳定，可在4℃冰箱中存放1年而不会降解。 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的分类： ?根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type?I）、第二型（Type?II）及第三型（Type?III）。 切割原理 原理：限制性内切酶能特异性结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。 切割方法 Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5- G↓AATTC-3），有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5-CCC↓GGG-3）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。示意图：5…G↓AATTC…3 →5… G AATTC…33…CTTAA↑G …5 →3… CTTAA G…5 与其他方法的比较 方法分别用淋巴细胞分离液、红细胞裂解液处理全血样本,用经典酚醇法、盐析法、碘化钾法、煮沸法提取DNA,比较这些方法所获得的DNA模板对PCR法检测HLA的影响,并进行了标本放置不同时间对DNA抽提结果的影响的实验.结果在所比较的几种方法中,经典酚醇法、盐析法、碘化钾法提取的DNA有较高的纯度和浓度,以其为模扳所进行的PCR结果较好,其中以碘化钾法的操作最为简便可靠.结论常规抽提DNA以碘化钾法最为适用,一月内4.C放置全血标本对人类基因组DNA抽提结果无明显影响. DNA的琼脂糖凝胶电泳分析 DNA的琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验步骤 1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g 琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂糖。 2、凝胶板的制备：置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表面保持0.5-1mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右，小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。静置0.5