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草氨酸钠对人非小细胞肺癌生长及放射敏感性的影响 中文摘要 中文摘要 目的 研究草氨酸钠作为乳酸脱氢酶（LDH ）抑制剂对人非小细胞肺癌生长及 其放射敏感性的影响，并初步探讨的初步相关机制，评价LDH 作为新型抗肿瘤药 物设计靶点的可能性。 方法 选用人正常肺上皮细胞HBE 作为对照组细胞，人非小细胞肺癌A549 、 H1975 、H1395、H1299 等细胞株作为研究对象。 (1) 四甲基偶氮唑盐比色法（MTT ）检测草氨酸钠对人非小细胞肺癌细胞及人 正常肺上皮细胞生长的影响。 (2)划痕愈合实验观察草氨酸钠对非小细胞肺癌细胞迁移能力的影响，transwell 侵袭试验观察草氨酸钠对非小细胞肺癌侵袭能力的影响。 (3)流式细胞术观察草氨酸钠对非小细胞肺癌细胞周期的影响，磷脂酰丝氨酸 外翻法（Annexin Ⅴ和PI 双染法）检测草氨酸钠对非小细胞肺癌凋亡的影响。 (4)采用活性氧（ROS ）检测试剂盒等，乳酸脱氢酶（LDH ）试剂盒,辅酶Ⅱ NADP(H)含量测定试剂盒，ATP 含量检测试剂盒等，经比色法分别检测草氨酸钠 对非小细胞肺癌中ROS 、 LDH 、NADP(H)及ATP 等能量代谢指标变化的影响。 (5)采用 Western blot 法检测草氨酸钠对非小细胞肺癌中生长代谢相关蛋白及 周期凋亡相关蛋白表达的影响。 (6)通过丹酰戊二胺(MDC)染色观察草氨酸钠对细胞自噬的影响，并进一步采 用透射电子显微镜(TEM)观察细胞内超微结构的变化。 (7)细胞克隆集落形成法检测草氨酸钠对非小细胞癌细胞放射敏感性的影响， 并采用细胞流式术检测草氨酸钠联合X 射线对细胞周期的影响。 (8) 彗星试验检测草氨酸钠对照射后非小细胞肺癌细胞 DNA 损伤的影响， Western blot 用于进一步检测草氨酸钠对照射后细胞内DNA 损伤修复相关蛋白的 影响。 I 中文摘要 草氨酸钠对人非小细胞肺癌生长及放射敏感性的影响 结果 (1)草氨酸钠明显抑制非小细胞肺癌 A549 、H1299 、H1975 、H1395 细胞的生 长，其半抑制浓度 IC50 分别为 58.53±4.74、62.67±4.16、32.13±2.50、19.67±1.53 mmol/L ，而草氨酸氨对正常肺上皮细胞的毒性较弱，IC50 为 96.73±7.60mmol/L 。 (2)加入草氨酸钠后，A549 细胞的划痕愈合能力明显下降，同时transwell 侵袭 试验表明，草氨酸钠明显抑制非小细胞肺癌A549 及H1975 细胞的侵袭能力。 (3)草氨酸钠引起非小细胞肺癌细胞A549 及H1975 显著的G /G 期阻滞，以及 0 1 S 期细胞比例的减少。进一步实验表明这种 G0/G1 期阻滞是GSK-3 β依赖的，而 且可被GSK-3 β抑制剂氯化锂所抵消。Annexin Ⅴ和PI 双染法表明在A549 、H1975 细胞中草氨酸钠引起的细胞凋亡及坏死不明显。 (4)加入草氨酸钠后，A549 细胞内乳酸脱氢酶（LDH ）活性、ATP 含量及 NADPH/NADP 比例均显著下降，与此同时，细胞内活性氧（ROS ）含量明显增加。 (5)草氨酸钠明显抑制非小细胞肺癌细胞中细胞周期相关蛋白Cyclin E 、Cylin B1 Cyclin D1、CDK2 及生长代谢相关蛋白p-c-Raf、 p-Akt 、 SIRT1、 FTO 等蛋 白的表达，同时增加p-Erk 、p-GSK-3β 的表达，而对细胞凋亡相关蛋白bcl-2 、bax 、 caspase-3 以及 p53 、NF-kB 、p-PTEN 、 p-PDK1 等蛋白的表达无显著影响。 (6)草氨酸钠显著增加 A549 细胞内酸性自噬小泡