基因工程第六章外源基因的表达.ppt

第六章 外源基因的表达 6.1 基因表达机制 6.1.1 外源基因的起始转录 是基因表达的关键 转录应被调节, 启动子应为诱导型(lac trp tac 等启动子) 6.1.2 mRNA延伸和稳定性 转录启始后, mRNA的延伸、终止及其稳定便成为关键阶段。 mRNA 应在细胞中保持稳定的拷贝数。 ?6.1.3 mRNA 的翻译 mRNA有效翻译需考虑的基本原则： AUG（ATG）为起始密码子 SD 序列应包括AGGAGG中的4个. SD 序列与起始密码子间距3-9bp 起始区周围序列无二级结构. 外源基因的主密码子与受体细胞的相同或接近. 主密码子:基因组中使用频率高的密码子 罕用密码子:使用频率低的 终止密码: E.coli. 一般用UAA. RF1识别UAA, UAG. RF2识别UAA, UGA. 6.1.4 表达蛋白的稳定性 避免表达蛋白降解的方法: ① 采用融合蛋白表达系统 ② 采用分泌蛋白表达系统 ③ 构建包涵体表达系统 ④ 选择无蛋白水解酶的受体。 6.1.5 目的基因沉默 基因沉默（gene silencing) 其作用机制主要有三种： 位置效应的基因沉默：整合入甲基化程度高、转录活性低的异染色体上，一般不表达。 转录水平的基因沉默：启动子的甲基化或外源基因的异染色质体。 转录后水平的基因沉默：RNA水平上, 基因可转录,但mRNA合成后被降解或被反义RNA或蛋白质封闭. 转基因植物和转基因动物中常见。 6.2 主要表达调控元件 6.2.1 启动子 ①序列特异性 几个保守的序列框。 ②方向性 启动子正反两种方向中只有一种具有启动功能。 ③位置特性 启动子只能位于所基因的上游或基因内的前端。 ④种属特异性 不同种属、不同组织有不同的启动子。 原核生物启动子 转录起始位点:多为CAT, 从第二个碱基开始。 -10区：TATAAT，一般在起始位点上游6bp处。 -35区：TTGACA，一般在起始位点上游35bp处。其中前个碱基高度保守 间隔区：-10区与-35区存在长度不等的间隔区，序列无保守性，间隔的长度非常重要。一般间隔16-18bp，E.coli.为17bp最好。 真核生物启动子 I型启动子：rRNA II型启动子：mRNA III型启动子：tRNA II型启动子：基本区和辅助区 基本区：转录起始位点及TATA框 TATA框序列为TATAA（T）AA（T），其中心位于转录起始点上游-20~-30处。 辅助区：-75处的GGT(C)CAATCT，称为CAAT框，在-100~-300处有GGGCGG，称为GC框。 6.2.2 增强子 能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。 结构与启动子类似，由多个元件组成，每个元件与一种或多种转录调控因子结合。转录调控区通常有一至多个增强子。每个均有一种特定的功能：如在特定的发育阶段起作用。 增强子的特性 双向性：正反方向均可 重复序列：独立行使功能 功能的行使与位置无关：可上游、下游或中间 特异性：功能行使有组织特异性或发育阶段特异性。 可调节同源基因，也可调节异源基因。 6.2.3 终止子 转录终止的位置 分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。 6.2.4 衰减子 调节转录的起始和终止. Trp操纵子 6.2.5 反义RNA (antisense RNA） 正常转录的RNA的互补RNA 反义RNA可在基因复制、转录和翻译上起调节作用，主要在翻译水平上调节。 反义RNA链与引物RNA互补结合，阻止DNA复制。 反义RNA链与mRNA 5`端互补结合阻止转录 反义RNA链与转录后mRNA互补结合，阻止翻译。 ?6.3 外源基因表达系统 原核生物作为基因表达系统的特点： ① 多数为单细胞, 异养，生长快，代谢易于控制，可迅速获得大量产物。 ② 基因组结构简单，便于操作。 ③ 含有质粒或噬菌体，便于构建表达载体。 ④ 生理代谢途径及基因表达调控比较清楚。 ⑤ 不具备蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 ⑥ 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。 6.3.1 大肠杆菌基因表达系统 大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。 应用最广泛的基因表达系统。 6.3.1.1　大肠杆菌基因表达载体 复制子：一段包含复制子起始位点和反式因子作用区在内的DNA片段。 大肠杆菌的表达载体一般是质粒。 启动子： 大肠杆菌的启动子与转录起始位点之间的距离为6～9 bp。 终止子： 有效控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA的稳定性，避免质粒上其他基因的异常表达。 核糖体结合位点： 核糖体的结合位点，转录起始位点下游的一段DNA序列，对mRNA的翻译起决定作用。