基因研究技术之文库构建.ppt

植物转基因转化技术 原生质体转化法 基因枪法 农杆菌介导法 电穿孔法 花粉管通道法 转化transformation：重组质粒DNA导入感受态细胞。G－受体细胞，产生感受态因子，将双链DNA吸附到细胞壁上，单链DNA插入细胞内(另一条链降解)，被特异性蛋白包裹保护而不被降解，单链DNA复制产生新转化子； 转染transfection ：将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程。与转化无本质差别 转导transduction ：感染，重组噬菌体DNA被包装成为有感染力的噬菌体颗粒，将重组DNA导入受体细胞中。比转染的克隆形成效率要高出几个数量级。 氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法 适用于大多数大肠杆菌菌株，转化效率高、简单快速、重复性好 成批制备感受态细菌，使每微克质粒DNA产生将近107个转化菌落。 可以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要 制备的感受态细胞可贮存于-70℃ ， 贮存时间过长会影响转化效率。 提高转化频率的措施 碱性磷酸酶处理法：阻止不带有DNA插入片段的载体分子发生自身再环化作用，破坏了其转化功能。 环丝氨酸富集法 使带有原来质粒载体的细菌致死 抑制空载体分子形成转化子。该法是依据外源DNA片段的插入作用，导致质粒的某种基因失活。四环素抗性基因tetr 高压电穿孔转化法(电转化法) 适用于真核细胞和细菌 优化参数(电场强度、电脉冲长度和DNA浓度等)，109-1010个转化体/μgDNA ，是感受态细胞转化率的10－20倍 调整电场强度和脉冲长度，细胞死亡率在50％-75％时，转化效率达到最高 制备细胞容易：将培养至对数中期的细菌加以冷却、离心，用低盐缓冲液洗涤并回收细胞。用10％甘油重悬细胞 3xl010个／mL，干冰速冻后置于－70℃贮存(有效期6个月以上) 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染 磷酸钙共沉淀转染 DEAE－葡聚糖介导的转染 Polybrene(聚季铵盐)的DNA转染 原生质体融合的DNA转染 电穿孔法DNA转染 慢病毒转基因技术 转染效率在很大程度上取决于所用受体细胞的型别，不同的培养细胞系，其摄取和表达外源DNA的能力相差达几个数量级 显微注射技术 文库构建 DNA的制备与片段化； DNA片段的分部分离与富集； 与载体连接并包装成文库； 从文库中分离筛选出含有目的克隆。 基因组DNA的提取与片段化 限制性内切酶法 局部消化，随机片段化； 常用4bp识别序列的限制酶，随机程度比识别序列为6bp的限制酶要高，Sau3A、MboⅠ 、Hae Ⅲ和AluⅠ。 双酶部分消化法/单酶部分消化法 优点:由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接； 缺点:目的基因内部也可能有该内切酶的切点，目的基因也被切成碎片。 分部分离与富集 按照载体类型，确定克隆片段的大小范围，对片段化的供体DNA群体进行分部分离，明显提高克隆效率。琼脂糖凝胶电泳、蔗糖梯度离心； 若目的基因的全序列位于一条DNA片段上，而不是分布在彼此交叠的数种片段上，那么它的序列片段就能够被适当地富集起来。 基因组DNA文库 限制性内切酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 从基因文库中分离筛选重组克隆 构建了基因文库，实现了基因的克隆。 筛选阳性克隆 将菌落/噬斑转移到硝酸纤维素薄膜上，吸附在NC膜上的噬菌体DNA经变性、洗涤、干燥等处理； 杂交缓冲液中与标记探针进行杂交，由膜的放射自显影/显色确定阳性克隆(噬斑)位置，从而筛选出含有目的DNA的重组克隆。 从文库钓取目的基因 * * Cloning by cosmids. The cosmid is cut at a BglII site next to the cos site. Donor genomic DNA is cut by using Sau3A, which gives sticky ends compatible with BglII. A tandem array of donor and vector DNA results from mixing. Phage is packaged in vitro by cutting at the cos site. The cosmid with insert recircularizes after it is in the bacterial cell. (From J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski, and M. Zoller, Recombinant DNA, 2d ed. Copyright ? 1992 by Scientific American Books.) 柯斯质粒pH