基因工程制药工艺.pptVIP

生物制药工程 主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@163.com 山东农业大学生命科学学院微生物系 第六章 基因工程制药工艺 6.1 基因工程制药微生物表达系统 6.2 基因工程大肠杆菌的构建 6.3 基因工程菌的发酵培养与控制 6.3 基因工程菌发酵培养与控制 6.3.1 培养基组成与控制 6.3.2 培养工艺与控制 6.3.3 产物诱导表达与终点控制 6.3.1 培养基组成与控制 营养与环境作用：碳源、氮源、无机盐和生长因子 工艺作用：消泡剂 筛选与表达：选择剂，诱导物 1、碳源 大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源。 酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。 添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。 浓度稍高后就表现出底物抑制作用。 葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。 2、氮源 直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。 不同工程菌对氮源利用能力差别很大，具有很高的选择性。 大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。 酵母：利用氨基酸为氮源。 3、无机盐 磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态。 基因工程菌生长提供必需的矿物质。 4、选择剂 维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。 两类：营养缺陷互补标记和抗生素抗性选择标记 发酵培养过程中质粒易丢失，使之成为宿主菌。为了保证质粒的稳定性，不丢失，根据质粒的标记基因，添加或缺陷选择剂。 基因工程大肠杆菌含有抗生素抗性基因，抗生素作为选择剂：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等。 基因工程酵母菌常用氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。 5、诱导物 诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。 诱导物成为产物表达必不可少的。 lac启动子表达系统：IPTG诱导。 甲醇营养型酵母：加入甲醇进行诱导。 6.3.2 培养工艺与控制 温度 溶解氧 pH 1、温度对工程菌生长的影响 符合三基点原则：最低，最适，最高。 大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度10℃。 大肠杆菌生长最适温度37℃，最高温度45℃。 酿酒酵母生长最适温度30℃，最高温度40℃。 生长与生产温度不一致。 较高温度表达量大，易形成包涵体。 策略：较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。 对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏。 策略：生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。 两端变温发酵培养： 前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度。 后期：较低温度发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。 温度诱导型大肠杆菌表达系统： 生长期维持37℃，生产期提高温度42℃。 2、pH值对发酵的影响 细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.5-7.5 真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.0-6.0 pH值影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。 干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。 乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。 了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，进一步设法控制pH在合适的范围内。 分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。 3、溶解氧 工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。无氧呼吸会导致大量的能量消耗，同时产生有机酸，对细胞生长极为不利，甚至有毒害。 从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力，在临界溶解氧浓度之上。 调节搅拌转速和通气量。 6.3.3 产物诱导与终点控制 一般情况下，目标产物对宿主是不利的 常用策略：诱导表达 根据启动子类型和目标产物表达的调控模式而定 当产率最大时，结束发酵。 在生产中应严格控制 适宜的诱导时间：非常重要 诱导物的浓度及其发酵温度，影响表达量，产物存在形式。 1、化学诱导表达 化学诱导型启动子：lac、tac、T7等 诱导时间：对数生长期 细菌：IPTG诱导 甲基营养型酵母：甲醇诱导 2、温度诱导表达 温度诱导型启动子：PL、PR 两段培养发酵 诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。 小结 培养基组成与控制 培养工艺与控制 终点控制 思考题 工程菌与宿主菌对培养基要求有何不同，为什么？ 影响工程菌培养工艺的主要参数是什么？如何优化控制？ 诱导物对生长和产物合成有何影响，如何选择使用？ Thanks for your attention * * 无需诱导 组成性分泌表达 GAP 毕赤酵母 甲醇 整合到染色