基因工程技术及应用.pptVIP

定义：基因工程是指将外源目的基因（一段 DNA片段）组合到载体DNA分子（质粒，噬菌体或病毒等）中去，再使它转染进入受体细胞（亦称寄主细胞），在受体细胞中外源基因得以增殖和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的目的蛋白质。 包含以下步骤： ? 获得目的基因 ? 构造重组 DNA 分子 ? 转化或转染 ? 基因表达(蛋白质产物的分离纯化) 目的基因的筛选和分离的方法：  ①直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。  ②人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 转化/转染 基因表达 重组 DNA 分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。表达通常是指目的基因编码的蛋白质合成。 基因工程的最后一步，是把所获得的蛋白质分离纯化，得到蛋白质产品。 三、基因工程的应用 1982 年美国 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。 ?转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。 转基因植物亦已在大田中广为播种。 ④工程菌在环境工程中应用 美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。 ⑤利用基因工程培育新型微生物 基因工程技术和应用 生物工程技术: 基因工程、蛋白质工程、微生物工程、酶工程、细胞工程等工程技术 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的技术方法及相关工作称基因工程，也称重组DNA技术.或重组DNA工艺学。 一、基因工程技术概述 基因工程是生物技术工程的核心部分。 目的： ① 分离获得某一有用的基因或DNA ② 获得有用的基因表达产物（蛋白质） 二、基因工程操作步骤 ?从mRNA合成cDNA:采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA)，除去mRNA后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA，从而得到双链DNA。 ④从基因文库中筛选： 基因文库： 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部分别转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。 方法：将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。 从基因文库中筛选目的基因常采取“钓”的办法，即印迹法。 ⑤利用PCR合成：如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR)技术，在体外合成目的基因，但此方法主要用于目的基因的扩增。 载体和目的基因的切断 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3‘-突出粘性末端和5’-突出粘性末端(cohesive end)三种情况。 相同限制性内切酶切割目的基因和载体DNA形成粘性末端互补，便于连接。 限制酶目前已经发现3600多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 限制性内切酶 识别特定的 碱基序列 载体和目的基因的重组 将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。? 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。 用质粒构建重组DNA分子 转化：以质粒作载体将质粒导入受体细菌。 转染：若质粒、病毒作为载体将重组子导入 动/植 物细胞，或以噬菌体作为载体将重组子导入细菌细胞。 受体细胞必须处在感受态才能接受外源性DNA。用CaCl2处理，增加细菌细胞壁的通透性。 重组DNA的筛选和鉴定 可采用以下方法进行：? 根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组质粒的细菌。 根据标志互补进行筛选： 当宿主细胞存在