多重耐药革兰阴性菌基因诊断和医院感染的临床、分子流行病学研究.pdfVIP

多重耐药革兰阴性菌基因诊断与医院感染的临床、分子流行病学研究 中文摘要 医院感染中革兰阴性菌约占60％-70％，是引起人类感染性疾病的主要病原 之一。近年来全球各地细菌耐药监测数据表明，革兰阴性菌对临床常用抗菌药物 耐药性日益严重，耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌、非发酵菌比例逐年升高， 且对其他临床常用抗菌药物也呈现多重耐药，但是针对这部分“超级细菌”的抗 菌药物研发明显落后，它所导致的感染治疗困难，病死率高，已成为医学界和公 众都非常关注和担忧的问题。 常规病原学诊断方法包括细菌培养、分离及药敏试验，所需时间长，难以及 时指导感染性疾病的病原治疗。随着分子生物学与细菌基因组学的发展，快速、 灵敏的核酸检测方法已开始用于病原学的快速诊断及某些耐药基因的检测。本课 题在分析临床常见病原菌共有的23SrRNA基因及革兰阴性菌主要耐药基因的基 础上，探索建立可用于检测多重耐药革兰阴性菌的快速基因诊断方法，并应用于 临床，有望为耐药菌早期病原诊断、耐药性分析提供客观依据，从而及时、正确 指导临床抗感染治疗方案的选择。 预防重于治疗，医院感染中绝大部分患者系经过直接或间接接触感染，属于 可控、可防的环节，切断传播途径有望减少医院感染的发病。因此对多重耐药革 兰阴性菌导致的医院感染进行流行病学及临床研究可为控制耐药菌传播提供依 据。本课题回顾性分析2005--一2011年华山医院共6年期间血流感染、中枢神经 系统感染患者的临床资料，总结院内不动杆菌感染的临床特点、菌株敏感性与预 后关系。同时对2011年3月2012年2月华山医院血液、脑脊液标本分离的革 兰阴性菌进行超广谱p．内酰胺酶、碳青霉烯酶、甲基化酶筛查以明确上述耐药基 因的流行情况。 本课题共包括以下三个部分： 第一部分多重耐药革兰阴性菌基因诊断方法的建立 基因芯片技术是近几年来快速发展的分子生物学技术平台，因其具有快速、 灵敏、特异、高通量、样本用量少等特点而被广泛应用于生物学研究的各个领域， 在细菌菌种鉴定、耐药基因检测、基因突变及多态性、基因表达谱分析等方面均 有不少探索性研究，但能否应用于临床常规检测仍有不少争议。基于细菌核糖体 核糖核酸(rRNA)基因序列中保守区和多变区相互间隔排列的特点，利用基因 序列保守区设计通用引物，利用多变区设计特异性探针，使基因芯片快速鉴定细 菌菌种成为可能。国内外先后有应用16SrRNA和23S rRNA基因检测细菌的报 万方数据 道，但对于菌株的耐药性无法得到明确的结果，难以正确指导临床抗菌药物的选 择。目前临床上多重耐药革兰阴性菌中对健康威胁最大的产碳青霉烯酶菌株，此 外甲基化酶可导致菌株对氨基糖苷类高度耐药，给治疗带来极大困难。本课题在 前期利用23SrRNA基因快速鉴定菌种的研究基础上，设计了KPC、NDM、VIM、 IMP型及OXA23、OXA5 甲基化酶耐药基因的PCR引物和探针，将耐药性检测的多对引物整合于1个PCR 反应中，然后将所有探针固定于同一张基因芯片上，通过PCR产物与基因芯片 杂交，可一次性明确菌株产常见碳青霉烯酶、甲基化酶情况，期望建立起能同步 完成病原及耐药谱检测的基因诊断方法。结果证实基因芯片用于检测NDM、 IMP、KPC、OXA23、OXA5 1、OXA58型碳青霉烯酶耐药基因，armA型甲基化 酶耐药基因杂交信号满意，可重复性好。但检测VIM型碳青霉烯酶和rmtB型甲 基化酶耐药基因杂交信号不明显，重复性差，仍需进一步优化探针设计。 第二部分多重耐药革兰阴性菌基因诊断方法的临床研究 血流感染是临床常见的重症感染性疾病之一，具有较高的发病率及病死率， 近年来发病率有上升趋势。由耐药菌导致感染的患者预后与能否及早针对病原选 用敏感抗菌药物治疗密切相关。为进一步评估基因芯片检测多重耐药革兰阴性菌 耐药