与重要疾病相关蛋白的结构和功能CB918800-G.docVIP

项目名称： 与重要疾病相关膜蛋白的结构和功能 施一公 清华大学 2009.1至2013.8 教育部 发生肺部感染，还可引发脑膜炎、胸膜炎、菌血症和中耳炎等严重疾病。肺炎链球菌是人类主要的致病菌之一，全世界每年约160万人因感染致病死亡。我国每年约有250万人患肺炎链球菌性肺炎，并造成其中12万人死亡，其危害远远大于麻疹和疟疾，是导致5岁以下儿童死亡的头号疾病。由于抗生素的大量使用，肺炎链球菌出现对青霉素和大环内酯类抗生素耐药，并且出现对其它抗生素的多重耐药，因此疫苗在感染预防中的作用越来越重要。 存在于肺炎链球菌表面的约500多种膜蛋白及膜表面蛋白在疾病发生过程中起着非常重要的作用，它们是细菌毒力和免疫逃逸系统的主要作用分子，同时也是药物设计的首选靶标和疫苗研发的重点。这些蛋白质大多数为毒力因子，它们通过共价连接或其它方式结合在细胞壁或细胞膜上，在肺炎链球菌的定殖和侵入过程中发挥功能。针对膜蛋白及膜表面蛋白研发蛋白质疫苗具有其它疫苗无法比拟的优势：生产成本低、对所有年龄组的人群产生保护作用、诱发免疫记忆等。但是目前，对这些表面蛋白的结构以及它们的毒力和免疫反应机制仍然知之甚少[37]。这些重要蛋白质三维结构的解析将为更为高效的新疫苗的研发和基于三维结构的新药设计提供重要的理论依据。 肺炎链球菌的大部分膜蛋白及膜表面蛋白按照结构特征可以分为三大类：通过与磷酸胆碱的非共价结合而固定在细胞壁上的胆碱结合蛋白（choline-binding proteins, CBPs）、具有LPxTG motif的sortase的底物蛋白、镶嵌于细胞膜中的脂蛋白（主要包括各种不同的转运蛋白）。我们将利用X射线晶体学手段解析上述蛋白中具有免疫原性的膜表面蛋白及其与宿主受体蛋白的复合物的精细三维结构，尝试利用杆状病毒介导的昆虫表达系统和酵母表达系统超量表达第三大类蛋白—镶嵌于细胞膜中的一些重要的转运蛋白并进行纯化、结晶和结构解析。对于一些重要的作用位点和相互作用界面，我们将利用核磁共振波谱学手段研究分子识别过程中的动力学特征。另外，对于一些新发现的功能未知的膜蛋白及膜表面蛋白，我们将利用微生物遗传学方法结合分子生物学手段研究其表达调控和生理功能，同时对基于蛋白质三维结构设计的抑制剂的功效进行系统验证和评估。 二、预期目标 总体目标： 膜蛋白结构生物学是当今结构生物学研究的最前沿、最重要的领域之一，已知的膜蛋白结构只有350个，其中还包含了大量外膜蛋白、同类膜蛋白的同源物、突变体等等，因此新颖膜蛋白的结构信息极其贫乏。我们的总体目标是解析有重要科学价值并与重大疾病相关的新型膜蛋白的高分辨率结构，探索真核膜蛋白表达结晶的普适方法，培养一批膜蛋白结构生物学人才，促进中国结构生物学在膜蛋白结构与功能领域进入世界领先水平。 五年目标： 摸索超量表达重组真核生物膜蛋白的体系，包括CHO细胞表达体系、昆虫细胞表达体系、酵母表达体系、细菌表达体系、体外翻译体系、植物表达体系等等，力求摸索出可以稳定大量表达各类真核生物膜蛋白并且完全保留生物活性的性价比最高的生物表达系统； 探索膜蛋白结晶条件的规律以及更适合膜蛋白结晶的沉淀剂、添加物； 解析γ-Secretase及类似膜蛋白酶的原子分辨率的结构，阐述其工作机理； 解析胆固醇代谢通路上重要的膜蛋白及其复合物的结构2-4个，揭示胆固醇代谢通路调控机理； 探索盒式突变技术和融合蛋白技术在GPCR结构生物学研究中的可行性，解析出1-2个多巴胺受体或其它膜蛋白的晶体结构。 解析肺炎链球菌具有免疫原性的膜表面蛋白及其与宿主受体蛋白的复合物的精细三维结构，并表达、纯化、结晶和结构解析重要的跨膜转运蛋白。 发表国际一流杂志论文（影响因子10以上）20篇以上，其中Cell、Nature、 Science论文5篇以上；培养一批膜蛋白结构生物学人才；使中国的膜蛋白结构生物学研究居于世界领先水平。 在结构生物学领域造就一支高水平的科研队伍，培养一批杰出的博士研究生（40－60名）、硕士研究生（10名左右）和博士后研究人员（10-20名）。 三、研究方案 1．学术思路 本项目的中心学术思想是发挥我国的人才资源优势，结合强有力的财政支持，集中力量攻克有重大科学意义、备受关注的膜蛋白γ-Secretase，与心血管疾病相关的胆固醇代谢通路上的一系列起调控作用的重要膜蛋白，几个GPCR蛋白的结构，以及致病微生物表面膜蛋白的结构。本项目所有4个课题的核心都是膜蛋白结构与功能的研究，彼此研究方向及方法互补。这些课题都是当今生命科学领域迫切希望看到的重要结构，任何一个结构的成功解析都将在国际生命科学界上引起巨大反响。参与本项目的清华大学、中国科学院生物物理所以及中国科学技术大学是我国结构生物学的研究中心。三个机构发挥各自优势，重点突破