PCR和简并引物设计分解.ppt

PCR技术及其在基因同源克隆中的应用 缪恒彬 2007.05.15 PCR技术的基本原理 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应( Polymorphism Chain Reaction )。 其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件---模板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR反应体系与反应条件 25ul 标准反应体系: 10×扩增缓冲液 　 2.5ul Mg2+ (25mmol/L)　　　 1.5ul　 　 dNTP (10mmol/L) 2.0ul　　　　　　 　 模板DNA (20ng/ul) 2.0ul 正向引物(10umol/L) 1.0ul　 反向引物(10umol/L) 1.0ul Taq DNA聚合酶 (5U/ul)　 0.2ul　 加双蒸水至 　25ul 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 PCR反应体系与反应条件 ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ④引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑤引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 设计引物应遵循以下原则： PCR反应体系与反应条件 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，一般的PCR反应核酸模板量在10~100ng都能得到有效扩增。 PCR反应条件的选择 PCR反应体系与反应条件 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃ lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 退火(复性)温度与时间：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。 Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 延伸温度与时间：一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 基因克隆方法 基因芯片技术 基因文库技术 功能蛋白组技术 PCR技术 mRNA差异显示技术 插入突变 图位克隆 酵母双杂交系统 生物信息学技术 同源基因克隆中的PCR技术 RT-PCR cDNA合成 简并引物设计 RACE-PCR 3’RACE 5’RACE 同源基因克隆中的PCR技术 cDNA合成 简并引物设计 选择同源基因 氨基酸序列 递交GENEBANK 进行BlastP /BLAST/ /blocks/make_blocks.html /blocks/codehop.html 选择相关的 氨基酸序列 递交服务器 进行Block Maker 同源区段结果 递交Codehop服务器 选择合适 简并引物 常用引物设计软件： Primer Premier 5.0 引物设计服务器： / 引物分析评价软件： Oligo 6.0 不同物种同源基因氨基酸序列选择 简并引物设计 选择同源基因 氨基酸序列 递交GENEBANK 进行Bla