DNA连接酶综述.pptxVIP

DNA连接酶;DNA连接酶的分类;DNA连接酶的特点;DNA连接酶催化反应的特点;DNA连接酶的催化作用;DNA连接酶作用于黏性末端;DNA连接酶的作用机理 ;DNA连接酶催化作用的机制分三步;若辅助因子是AMP，此处产物应为ppi;反应温度 温度是影响连接酶效率的主要因素，酶催化的最适温度37℃，但氢键不稳定。催化黏性末端连接的最适温度应介于酶作用速率和末端结合速率之间。见表1 酶浓度 T4DNA连接酶的酶活性的衡量：Weiss单位规定，37℃ 20min可使1nmol/L 32P在有机焦磷酸和ATP间产生交换的酶量为一个活性单位。同样情况，黏性末端比平末端所需酶浓度低。适合温度范围内，较高温度下酶催化效率高。 ATP浓度 反应终ATP浓度变化范围10μmol~1mmol/L，一般情况ATP最适终浓度0.5mmol/L。5mmol/L时对平末端连接有影响，7.5mmol/L时有广泛抑制作用。 载体分子和目的DNA片段构建重组DNA分子 环化，一定浓度的小分子DNA片段本身末端进行分子内连接，成环状DNA分子的现象。一定长度的DNA分子，其浓度降低有利于分子环化。较高浓度的DNA，有利于分子间连接，形成线性二聚体或多聚体分子。;DNA片段自身环化与连接后环化的比较