chapter5-1微生物的酶课程.ppt

影响酶促反应速度的因素 一、底物浓度 底物浓度与酶促反应速率的关系呈双曲线，即当底物浓较低时，反应速率与底物浓度呈正比关系，表现为一级反应； 当底物浓度逐渐增加时，反应速率不再按正比关系升高，反应表现为混合级反应；当底物浓度达到足够高时，反应速率与底物浓度几乎无关，反应达到最大反应速率，表现为零级反应。 1.3 构成酶发挥作用的结构 酶的活性中心 调控部位 5．异构酶类（isomerase） 催化异构化反应 例： 6．连接酶类（ligases, 也称synthetases 合成酶类） 将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。 例： 三、酶的分离、提纯及活力测定 （一）酶的分离提纯(不讲) 基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液. 基本操作程序： 选材：微生物（微生物发酵物: 胞内酶，胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等）。 抽提：加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等） 分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。 纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。 酶的制剂形式： 固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥） 液体 保存：低温下短期保存。 （二）酶的活力测定 概念 酶活力：又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，通常用在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。 基本原理:酶是蛋白质，种类多，结构复杂多样，一般对酶的测定，不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反应的能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即V=K［E］），故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。 （二）酶的活力测定 酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物(P)的生成（增加）量或底物（S）的消耗（减少）量。即测定时需确定三种量：加入一定量的酶；一定时间间隔；物质的增减量。 测定酶活力常有以下几种方法： 在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化学反应量（终止时与起始时的浓度差），这时测得的是初速度。 在一定条件下，加入一定量底物（规定），再加入合适量的酶液，测定完成该反应（底物反应完）所需的时间，（非初速度，为一平均速度）。 动态连续测定法。在反应体系中，加入酶，用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物的消耗或产物的生成。 快速反应追踪法。近年来，追踪极短时间（10-3s以下）内反应过程的方法和装置已经应用。 （三）酶活力的表示方法 酶活力单位 酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示，单位为mol/min等。 酶活力单位的基本定义为：特定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。 国际单位： 用活力单位U（Unit）表示，许多酶活力单位都是以最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成1μmol产物所需的酶量为一个酶活力单位。 一个“Katal”单位是指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。Kat和U的换算关系：1 Kat=6×107U，1U=16067n Kat 比活力（specific activity） 酶的比活力是每单位（一般是mg）蛋白质中的酶活力单位数（如：酶单位/mg蛋白），实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂）），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。  在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。 回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力 ［总活力=比活力×总体积（总重量）］ 1.2 酶促反应的速度及其影响因素 二、 抑制剂 三、 激活剂 四、酶浓度 五、温度 六、pH值 在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。 一、底物浓度对酶反应速度的影响 （一）在酶浓度，pH，温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示： 酶促反应动力学： （二）米氏方程 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对