Chapter9常见HPLC问题的故障排除_1课程.ppt

常见HPLC问题的故障排除 目录 色谱问题潜在的来源 性能监测 反压 谱带展宽 色谱问题故障排除 峰形问题 保留时间问题 额外的峰 基线问题 系统维护与保存 溶剂注意事项 色谱柱保存 色谱问题的可能根源 流动相 进样器 在线过滤器 色谱柱 检测器 样品 泵 保护柱 连接管线及接头 积分仪/记录仪/软件 故障排除的策略 性能监测 反压 谱带展宽 谱带展宽 怎样在优异的分离度下得到良好的峰形?怎样得到好的分离以及尖锐的峰形？ 好的峰形谱带 – 好的分离 (良好的机械和化学性能) 性能监测 设置一个标准物质和一组参考的参数 使用样品优化试验，定义一系列的条件 使用与成产商一样的测试 使用自己的方法 性能监测 使用与生产商一致的测试 优点 结果可比较 缺点 只能检查色谱柱的柱效，保留与不对称因子 需要特定的色谱柱流动相与测试化合物 使用自己的方法 监测至少一个峰 特定峰对的理论塔板数（N），不对称因子（As），保留（k’），选择性（α） 性能监测-反压 反压太高? 除去色谱柱，压力是否正常？ 更换/冲洗色谱柱 从系统的末段，系统地除去管路/模块，压力是否正常？ 更换管路/维修模块 反压太低/压力波动？ 流速正确否？ 泵内有空气 流动相脱气 检查渗漏 系统监测-反压 溶剂粘度 性能监测 柱外谱带展宽效应 进样体积 进样器 管路连接 进样器到色谱柱 色谱柱到检测器 螺丝和锥箍 检测器体积 柱外谱带展宽 观察到的谱带展宽σtot 是所有对谱带展宽效应有贡献的总和 色谱柱 柱外σEC 仪器组件 测量系统的谱带展宽 测定步骤 从系统中取下色谱柱 将进样器与检测器直接连接 流速 1.0ml/min 检测器灵敏度 0.5-1.0AUFS 检测器时间常数 0.2s或者更小 将柱效测定样品用流动相稀释10倍，进样量2ul 测定谱带展宽 系统谱带展宽对柱效的影响 柱外展宽效应 连接管路在系统谱带展宽上的影响 注意: 较长的管路制造了更多的谱带展宽 色谱柱安装及连接的机械因素 色谱柱安装及连接的机械因素 不恰当安装的影响 故障排除中常见的问题 良好的色谱图 色谱问题故障排除 峰形问题 保留问题 额外的峰 基线问题 峰形问题 在线过滤器/保护柱污染 色谱柱受损 次级相互作用 色谱柱超载 质量超载 体积超载 其他的柱外效应 采样速率 检测器时间常数/滤波常数 峰形问题 机械问题 管路与接头 色谱柱塌陷 在线过滤器污染 进样器问题 化学问题 样品溶剂问题 峰形问题 在线过滤器污染 峰形问题 所有的峰都有变化 色谱柱 连接 更换筛板 再生或者更换色谱柱 色谱柱被破坏 pH2, 键合相水解 pH8, 硅胶基质溶解 色谱柱塌陷 什么导致了色谱峰拖尾 不恰当的样品溶剂 峰展宽 / 体积过载 峰展宽 / 体积过载 色谱柱上的样品浓度/质量过载 检测器滤波常数的影响 保留时间问题 重现性 温度 pH控制 离子对 泵运行 保留时间重现性 非色谱柱的影响 溶剂组成 在k与体积%之间的指数关系 当溶剂组成变化1%，保留时间变化5%-15% 疏水塌陷/去浸润 当使用有机相比例较低的流动相（极性较高的）时，观察到保留完全丧失的现象 使用含碳量较高的色谱柱时经常发生 实例：使用100%水溶液流动相，进样77针，运行时间超过20小时，保留时间皆比较稳定 但当停止流速后，重新再加上流速时，保留丧失。此现象表明：当色谱柱卸压时，流动相被排出孔 什么是“疏水塌陷”？ 导致疏水塌陷的可能机理 浸润理论 强制液体进入孔内是需要压力的 浸润理论: C18 –硅胶上的水vs. 甲醇 重新浸润“脱水”的固定相 使用含有40%以上的甲醇或其它极性有机溶剂（其它有机溶剂浸润时所需的百分比可能会不同） 通过降低接触角来达到浸润目的 不要试图用压力迫使水溶液流动相重现回到孔中 不实际，因色谱柱出口在大气压下 保留时间重现性 非色谱柱因素 温度 增加温度降低保留 温度每变化1oC，保留时间变化1%到2% 选择性漂移（通常较小） 保留时间重现性 非色谱柱因素 额外的峰 等度色谱 - 宽峰 -- 来自以前的进样 基线故障排除 基线噪音大 流动相中有气体 溶剂脱气 流动池中有气泡 在出口处使用0.009”的管路 色谱柱上的污染物被洗脱 用强溶剂冲洗色谱柱 渗漏 修复漏液处，更换接头 电噪音 除去电噪音的来源 屏蔽电缆，清洁触点 检测器灯能量低 更换灯 灵敏度太高 降低灵敏度，调节增益 检测器流动池脏 清洁流动池 同步的噪音 大多数情况下都是泵引起的 泵头中存在空气 将溶剂脱气，并重新灌注泵 单向阀问题 重组或者更换阀 柱塞杆断裂 更换 混合问题 增加系统体积 电噪音 改变电路，除去来源