1分子克隆解说.pptVIP

转化步骤 制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中加250 ?l Amp+250 ?l X-gal（显色底物）+25 ?l IPTG（诱导物），混匀后倒入灭菌培养皿中； 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 每组6管感受态细胞分别加DNA连接产物（4管，各10?l ）、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照，0.1?l）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟； 热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒（注意：勿摇动离心管）； 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟； 复苏：每管加200?l SOC培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏； 布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板； 培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时 即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）。 注意： 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37 ℃培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将?－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。 电转化感受态细胞的制备（一） 前夜接种受体菌（DH5?），挑取单菌落于LB