第八章免疫学检测方法浅析.ppt

PCR特点及应用： 优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。 应用：（1）基因组DNA分析； （2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断。 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。 原位杂交技术 是一种能够从形态学上证明特异性的DNA和RNA存在于制备的个别细胞，组织部分，单细胞或染色体中的技术。 原理是含有互补序列（探针）的被标记的单链DNA或RNA片段在适当的条件下与细胞的DNA或RNA杂交形成稳定的杂交体。 间接标记：将半抗原（如生物素或地高辛）附着于探针上，然后用标记的结合蛋白（如亲和素）检测或者用特异性的抗体检测靶探针杂交体。 冰冻切片 4％多聚甲醛固定 酸处理 蛋白酶K消化 后固定 预杂交 碱变性 加入变性探针，38℃杂交12 – 16 h 漂洗 显色 中性红衬染 脱水，封片 原位杂交 预杂交（65℃，2 h ） 加入碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体 样品变性 点样 固定 杂交过夜 洗膜 平衡膜 显色 观察结果 斑点杂交法（Dot-Blot） 通过原位杂交技术检测感染LCDV牙鲆的囊肿细胞、肾、肠和鳃。阳性部位有蓝色沉积物（箭头所示），bar = 50 μm。 直接ELISA 间接ELISA 间接酶联免疫吸附试验 操作步骤如下： （1）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育60min。 （2）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （3）加AP-IgG 为第二抗体，37℃湿盒中孵育45min。 （4）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （5）加NBT/BCIP底物缓冲液发色10min， （6）出现颜色加终止液终止反应。 （7）用酶标分析仪在405nm,处测定各孔的吸光度，计算P／N（样品光吸收值与阴性对照的值），判定ELISA反应结果。大于2.1时可判断为阳性。以最大显色至阳性的显色孔50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。 图 DOT BLOT方法筛选结果图。 免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布 细胞免疫化学法检测病毒感染 四、Western blot 是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。 原理及步骤 样品 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白 （SDS) 转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质 West Blot 图：淋巴囊肿病毒与抗血清的Western blotting结果 免疫电镜技术 免疫电镜技术（immune electron microscopic technique）是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子水平。主要有以下几种技术。 铁蛋白抗体法 酶标记抗体法 重金属标记抗体法 图 胶体金标记免疫电镜结果[(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm] 胶体金免疫技术 胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所有的大分子物质都可被金标记，而且标记后大分子物质活性不发生改变。 当抗原和金标抗体反应时，肉眼可见红色或粉红色斑条（点）,在显微镜下观察，抗原抗体结合处为黑褐色的颗粒。 斑点免疫金渗滤法（DIGFA）的应用 与研究进展 是20世纪八十年代发展起来的一种免疫学检 测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测 HBsAg、HCG 和HIV等。 斑点免疫金渗滤法原理： NCM为固相载体通过渗滤抗原与抗体在膜上快速反应标记的胶体金堆积显色。 胶体金 抗体 抗原 NCM 吸水垫 临床应用： 间接法测抗体： NCM 抗原样品抗体金标抗抗体显色 夹心法测抗原： NCM多抗样品抗原金标单抗显色。 直接法检测抗原 NCM病毒金标单抗显色