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第二章 分子克隆工具酶 分子克隆工具酶 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。 工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 工具酶 核酸内切酶 核酸外切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA及RNA修饰酶 单链核酸内切酶 1 限制性内切酶 1.2 限制性核酸内切酶的命名 命名原则： 第一个字母（大写, 斜体）： 该酶来源的微生物属名； 第二、第三个字母（小写、斜体）：微生物的种名； 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写） 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 1.3 限制性核酸内切酶的分类 1.3.1 Ⅰ 型限制性内切酶 1.3.2 Ⅱ 型限制性内切酶 1.3.3 Ⅲ 型限制性内切酶 1.3.1 Ⅰ型限制性内切酶 功能：限制、修饰 特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）； 应用：不常用。 1.3.2 Ⅲ型限制性内切酶 功能：限制、修饰 特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3`端24-26bp处。 应用：数量很少，分子克隆中无实际作用。 1.3.3 Ⅱ型限制性内切酶 功能：识别并特异切割DNA分子。 即通常所指的DNA限制性核酸内切酶； 反应特点：仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异性的片段； 应用：种类繁多，分子克隆中最常用的内切酶。 (1) 基本特性 识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；最常见的为6个碱基. 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC ↓GGG) (2)同裂酶（isoschizomer） ? 识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同 。 ① 同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同 HindⅡ 与 HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC ， HpaⅡ 与 HapⅡ 识别切割位点为 C↓CGG MobⅠ 与 Sau3AⅠ 识别切割位点为 ↓GATC 。 (3) 同尾酶 有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudamer) 如： BamH I : G↓GATCC Bgl II: A↓GATCT 1.4 限制性核酸内切酶活性及其影响因素 DNA末段的长度对限制酶切割的影响 需要在识别序列两端存在一定长度的非识别序列增加切割效率 位点偏爱（Site preference） 某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。 星星活性 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 限制酶的特异性变化方式与酶的种类和所用的条件有关，最普遍的活性变化来自 1 个碱基的变化、识别位点外层碱基的随意性，以及单链缺口。 引起星星活性的因素有甘油浓度高（5%），酶过量（100U/ml），离子强度低（25mM）， pH 值过高（8.0），或是加了有机溶剂如 PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、 sulphalane 等等，或是用其它二价阳离子如 Mn2+ 、Cu2+、Co2+ 或 Zn++ 代替了 Mg2+ 。但不同的酶对上述条件的敏感性不一样，如 PstⅠ 比 EcoRⅠ 对高 pH 更敏感，但后者对甘油浓度更敏感。 部分切割双链DNA的内切酶也可以切割单链DNA 通过酶切和连接可产生新的酶切位点 酶切位点在基因组中分布的不均一性 1.5 限制酶的用途 1.???? 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制片断 2.???? 建立限制酶（物理）图谱绘制 3.???? 构建基因文库 4.