响应面法优化植乳杆菌和凝结芽孢杆菌冻干保护剂的研究.docVIP

响应面法优化植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌冻干保护剂的研究 摘 要:采用单因素实验和响应面实验设计联用的方法，筛选优化植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌真空冷冻干燥的保护剂配方。单因素实验结果表明: 脱脂奶粉、麦芽糖和谷氨酸钠 3 种保护剂效果较好，能够显著提高菌种对冷冻干燥环境的耐受能力。以细胞存活率为响应值，混合保护剂的最佳配方为脱脂奶粉 7. 06%、麦芽糖 6. 46%和谷氨酸钠 6. 70%，植物乳杆菌冷冻干燥存活率达到 92. 95%，凝结芽孢杆菌的冷冻干燥存活率达到 94. 1%。 关键词:植物乳杆菌; 凝结芽孢杆菌; 真空冷冻干燥; 保护剂; 响应面法 直投式发酵剂是一种不需活化和扩增便能直接应 用于生产的新型发酵剂，具有活菌含量高、菌种保质期 长等优点，也防止了菌种退化和污染，提高了发酵制品 工业的劳动生产率和产品质量 ［1］ 。由于菌种对热刺激 的敏感性，直投式发酵剂工艺上多采用真空冷冻干燥 法，冷冻和干燥过程中会使部分细胞损伤、死亡及某些 蛋白酶分子钝化 ［2］ 。为了提高菌种冻干后的存活率，冻 干前加入保护剂减少冻干损伤是必要的，使其最大限度 发挥保护功能，提高发酵菌剂的存活率 ［3］ 。不同的保护 剂各有优缺点，单一保护剂往往不能满足菌体抵抗外界 恶劣环境的条件，而复配保护剂中各保护剂在冷冻干燥 中则发挥各自的特性并能起到增效作用 ［4］ 。 本研究以凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌为试验菌株， 采用单因素实验选择几种效果较好的冻干保护剂，再以 植物乳杆菌为试验菌株，采用 Design － Expert 软件的中 心组合设计方法设计响应面试验对几种保护剂的最佳 水平和交互作用进行研究探讨 ［5］ ，然后对凝结芽孢杆菌 进行冷冻干燥实验，从而筛选出适用于两菌种的优良复 合保护剂。 1 材料与方法 1. 1 材料与设备 凝结芽孢杆菌 ( Bacillus coagulans) ，四川理工学院 实验室保藏; 植物乳杆菌 ( Lactobacillus plantarum) ，购 于四川微生物菌种中心; MＲS 固体培养基; MＲS 液体培 养基; MJ － 250 生化培养箱( 上海美谱达仪器有限公 司) ; LGJ － 02 冷冻干燥机( 上海久世环保科技有限公 司) ; 0. 22 μm 滤膜( 上海海凡滤材有限公司) ; TDL －5C 型离心机( 上海安亭科学仪器厂) 。 1. 2 试验方法 1. 2. 1 工艺流程 菌种活化→富集培养→离心收集菌体→加保护剂 →活菌计数→预冻→真空冷冻干燥→冻干粉→活菌计 数 1. 2. 2 试验设计 通过单因素试验确定对细胞冻干存活率影响突出 的几个因素; 然后利用响应面设计方法中的 Box － Behnken Design 进行试验。1. 2. 3 菌体制备 菌种以 5% 的接种量接种于 MＲS 液体培养基中， 30 ℃ 下培养 18 － 22 h，镜检无杂菌后，等量分装于无菌 离心管中，4000 r/min，4 ℃离心15 min，弃上清液收集菌 体。 1. 2. 4 保护剂的制备 预先将脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸 锰、甘露醇、谷氨酸钠、L － 半胱氨酸分别取一定量溶解 于 100 mL 无菌水的试管中，其中，氨基酸类和糖类保护 剂溶液用 0. 22 μm 孔径的滤膜过滤除菌，其它保护剂溶 液 115 ℃，灭菌 15 min，备用。 1. 2. 5 活菌计数 平板混菌计数法( 参照 GB/T4789. 2 －2003) 。 1. 2. 6 真空冷冻干燥 在无菌操作台上，将离心所得菌泥样品用灭菌后的 保护剂溶液冲洗到无菌培养皿中，放在 －80 ℃条件下预 冻 2 h，待样品完全冻结后迅速转移到冷冻干燥机中冷 冻干燥 24 h，菌粉含水量 3% －5%即可收获成品。 1. 3 菌种存活率的计算 存活率 = 冻干后样品测得的活菌数 冻干前样品测得的活菌数 × 100% 2 结果与分析 2. 1 保护剂单因素实验 根据保护剂对菌体冷冻干燥的保护机理，结合有关 文献报道 ［6-7］ ，选取脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀 粉、硫酸锰、1 甘露醇、谷氨酸钠、L － 半胱氨酸作为冷冻 干燥保护剂，以存活率为指标，考察对凝结芽孢杆菌与 植物乳杆菌的冻干保护作用，结果见表 1。 表 1 保护剂单因素实验结果 保护剂 植物乳杆菌 存活率( %) 凝结芽孢杆菌 存活率( %) 脱脂奶粉 10% 78. 3 82. 5 麦芽糖 10% 70. 4 74. 6 蔗糖 10% 25. 6 42. 1 可溶性淀粉 10% 22. 8 34. 7 硫酸锰 5% 33. 7 56. 9 甘露醇 10% 52. 3 47. 6 谷氨酸钠 5% 51. 2 65. 3 L － 半胱氨酸 5% 23. 3