部分修改-酶工程实验-权春善论述.docVIP

实验一 紫外吸收法测定蛋白质含量 一、实验目的 学会用紫外吸收法测定蛋白质含量的方法。 二、实验仪器 紫外分光光度计 三、实验原理 大多数蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280 nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。但是核酸在280 nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260 nm，warburg等测定了酵母烯醇酶和酵母核酸在280 nm和260 nm时A）的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。 该方法是以酵母烯醇酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式，而不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来误差。 四、方法步骤 1．取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中，于分光光度计波长280 nm和260 nm，分别读取A280和A260，用蒸馏水（缓冲溶液或盐溶液，视样品溶液而定）为比色空白对照。 2．根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。 蛋白质含量（mg/ml）=1.55A280—0.76A260 五、实验报告 计算所测材料蛋白质的含量。 六、思考题 1测定蛋白质含量的方法有哪些，它们所根据的原理是什么？ 2试比较测定蛋白质含量的几种方法的优缺点。 一、实验目的掌握酶。 二、实验原理 pH7.5 条件下，每分钟水解酪蛋白生成l μg酪氨酸所需的酶量为一个活力单位。 活性测定步骤： （1）将10%的三氯醋酸和1 mL 1%的酪蛋白溶液在40℃中保温。 （2）取2支试管，分别标记成B0和S。 （3）在B0试管中加入l mL样品（酶）溶液，40℃保温10 min，加入三氯乙酸溶液4 mL，在室温下静置10 min，立即加入酪蛋白溶液1 mL，摇匀，离心，收集上清液。 （3）在S试管中加入1 mL酶液。量取1 mL 在40 ℃中保温的1%的酪蛋白溶液，迅速加入至试管中混匀，于40 ℃反应10 min，加入4 mL10%的三氯乙酸终止反应，摇匀，离心，弃沉淀，留上清。 （4）在275 nm波长下，以B0为空白，测定S上清液的吸光度。 注意：比色皿用石英比色皿，不能用玻璃比色皿。 标准曲线的绘制：不同浓度的L-酪氨酸标准溶液的配置如表1所示，直接用紫外分光光度计测定其吸光度A275nm，以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（通过零点），根据作图或者用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值（应在130-135范围内）。 表1 标准曲线的绘制 管号 酪氨酸标准溶液的浓度 （μg/ml） 取100μg/ml酪氨酸标准溶液的体积（ml） 取水的体积 （ml） 0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 酶活力计算公式： U/mL = A×K×6/1/10×n×E A： 样品的平均吸光度 K：吸光常数 6：反应试剂总体积（mL） 1：吸取酶液1mL 10：反应时间10 min n：稀释倍数 E：紫外法与folin法的换算倍数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77一、实验目的 （1）学习和掌握酶分子的化学修方法。 （2）了解化学修饰对酶活性的影响。 二、实验原理 酶分子中的许多侧链基团可以被化学修饰。这种修饰可以帮助了解哪些基团是保持酶活性所必需的，哪些基团对维持酶的反应并不重要。当化学修饰试剂与酶分子上的某种测链基团结合后，酶的活性降低或者丧失，表明这种被修饰的残基是酶活性所必需的。反之亦然。 酶分子中有许多可被共价化学修饰，如巯基、羟基、咪唑基胍基、氨基和羧基等。可以用来进行化学修饰的试剂也很多，如 5,5- 二硫代双（2- 硝基苯甲酸）（DTNB）和 N-乙酸马酰亚胺（NEM）是巯基的修饰剂，可以用来鉴定半胱氨酸残基是否是酶活性所必需的。磷酸吡哆醛可以与赖氨酸残基起反应； 2,3- 丁二酮则可以和精氨酸残基起反应。本实验以为材料，分别以 DTNB、磷酸吡哆醛化学修饰剂，研究活性所必需的残基。 三、实验仪器与试剂 1. 实验设备：恒温水浴、紫外可见分光光度计 2. 木瓜蛋白酶溶液：用0.01 mmol/L磷酸缓冲液配制，浓度mg/mL。 3. DTNB（2-硝基苯甲酸）：浓度配制成0.40mmol/L 4. 磷酸吡哆醛：浓度配制成4 mmol/L 5. 0.01mmol/L磷酸缓冲液（pH7.5）： 6. mg/mL 半胱氨酸 7. g/mL 赖氨酸 四、实验步骤 1. 分别用DTNB、磷酸吡哆醛对木瓜蛋白酶进行修饰。 五、 结果与分析 (1) 以修饰剂浓度为横坐标，以残存酶活性为纵坐标，分别绘制出修饰剂浓度变化对酶活性的影响。 (2) 分析木瓜蛋白酶活性所需的基