蛋白质的相互作用研究方法研讨.ppt

两个或两个以上的蛋白质结合在一起执行生物学功能时，发生相互作用。 蛋白质－蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。 第三节 蛋白质的相互作用的研究方法 免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down assay 荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET） 双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC 酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 其它方法 二、GST融合蛋白进行Pulldow实验 1 原理 细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。 两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用 2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4oC 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意：该实验设立GST对照，反应均在4oC进行 2008年诺贝尔化学奖 四、Bimolecular Fluorescent Complementation 蛋白质与小分子化合物的相互作用是进行药物设计的基础。基于结构的药物设计在药物的研发中已取得较大的成功，近年来通过化合物数据库与蛋白质结构的分子对接进行虚拟筛选大幅度地提高了先导化合物发现的成功率。 写出两种检测蛋白质之间的是否有相互作用的方法？请写出主要操作步骤。 （1）它并非对所有蛋白质适用。 融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前已经在表达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质尤其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而影响筛查结果. 3. 双杂交系统的缺陷 （2）假阳性的发生较为繁多。 在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型：Ⅰ型：表达单独的AD-Y融合蛋白即可激活转录。Ⅱ型：表达AD-Y融合蛋白和空BD载体即可激活转录。Ⅲ型：表达AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白即可激活转录。 3. 双杂交系统的缺陷 （3）在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表型。为了抑制背景表达而在培养其中添加的3-AT（3-Aminotriazole)或6-Azauracil也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相互作用可能会因此而被掩盖。 （4）还应意识到的一点是，虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白质相互作用，但其中部分蛋白质可能处于不同的细胞类型、细胞空间或生长发育的不同时期，生理状态下是不可能发生相互作用的 。 * 使蛋白质到发挥作用的位点。 使蛋白质的构象发生改变，激活或抑制。 1. 原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。 优点：生理条件下的结合 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用 一、免疫共沉淀 2.方法 1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次 2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min 3) 12000rpm 离心 30min 4）收集上清并加入适量抗体，4oC摇动1h～过夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶