蛋白质化学(李信)研讨.ppt

蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性作用（denaturation）。 1.蛋白质变性的概念 2.蛋白质变性的因素 物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等； 化学因素：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢剂、重金属盐等； (三)蛋白质的变性 生物活性丧失（酶）； 溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）； 基团位置改变； 对蛋白酶敏感性增大。 3.蛋白质变性后的表现 (三)蛋白质的变性 4.蛋白的复性 蛋白质的变性作用若不过于剧烈，则是一种可逆过程。高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性(renaturation)。 大多蛋白质变性后，很难复性。 (三)蛋白质的变性 (四)蛋白质的沉淀 加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质的胶体溶液就不稳定,并将产生沉淀。 能使蛋白质沉淀的试剂有： 1. 高浓度中性盐 （NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl 这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分离制备。 2. 有机溶剂 丙酮、乙醇 3.重金属盐 Hg2+、Ag+、Pb+ （与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构） 4.生物碱试剂和某些酸类物质 苦味酸、单宁酸 三氯乙酸、磺基水杨酸等 （与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐） 5.加热变性沉淀 (四)蛋白质的沉淀 (五)蛋白质的颜色反应 1. 双缩脲反应 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定。 2. 酚试剂（Folin-酚试剂）反应 蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定. (五)蛋白质的颜色反应 3. 茚三酮反应 由于蛋白质多肽链两端有游离的?-NH2和?-COOH，所以蛋白质也可以和茚三酮发生反应。4. 考马斯亮兰 与蛋白质反应形成蓝色透明物质，在595nm下进行比色。 (五)蛋白质的颜色反应 (六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定 1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则 （1）前处理（Pretreatment）细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。 （2）粗分级（Rough fractionation） 当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。 （3）细分级（Fine fractionation） 是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。 （4）结晶（Crystal）由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。 2.蛋白质分离纯化的一般方法 （1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法 透析（dialysis）和超滤 （ultrafiltration） (六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定 b. 密度梯度（区带）离心 c. 凝胶过滤（gel filtration） 葡聚糖凝胶过滤 （2）根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法 等电点沉淀（isoelectric precipitation） 蛋白质的盐溶和盐析 有机溶剂分级分离 （3）根据蛋白质电荷不同的分离方法 电泳--在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的电极移动，这种现象称电泳（electrophoresis）。 影响迁移率的因素：电位梯度 电流密度 导电性 环境pH （分子电荷） 离子强度 分