冷冻保存原理-张兆旺解释.ppt

动物繁殖原理与技术 冷冻保存生物材料理论与实践 张兆旺 甘肃农业大学动物科学技术学院 1.卵母细胞和胚胎在冷冻/解冻过程中死亡的原因 （1）物理损伤（胞内冰晶） 温度下降到细胞悬浮液冰点时，首先使细胞外溶液中的水结冰，细胞内此时由于原生质的作用处于过冷却状态（低于冰点而未结冰的状态），随着温度的进一步下降和胞外冰晶的增长出现了一种胞外溶液渗透压逐渐高于胞内过冷溶液的不平衡状态。 要达到平衡，要么是胞内水分外流；要么是胞内水分就地结冰。出现哪种情况取决于温度下降的速度。 快速降温的结局 如果温度下降很快，超过了细胞膜具有的渗透能力（这种能力与细胞种类大小和温度等因素有关），胞内水分就来不及外渗，而是就地结冰，冰晶体积达到一定程度就会对细胞膜和细胞器造成机械损伤（挤压、穿刺），最终导致细胞死亡，这就是冷冻情况下的物理损伤。 胞内冰晶的预防 为使细胞内部不产生冰晶，冷冻保存液中必须添加抗冻保护剂物质。胚胎或卵子的冷冻保存中，常采用的抗冻保护剂除丙三醇外，还有乙二醇、丙二醇、DMSO和乙酰胺等。这些物质的分子量不超过100道尔顿，可以自由地通过细胞膜，所以被称作渗透性抗冻保护剂或细胞内液抗冻保护剂。细胞内、外液的抗冻保护剂的摩尔浓度较高的情况下，使溶液的冰点下降，具有抑制冰晶生成的作用。 （2）化学损伤（渗透效应或溶液效应、胞外冰晶） 降温较慢时，胞内的水分不断外流然后结冰，即胞外冰晶。细胞外液的水分形成冰晶后使未结冰溶液浓度升高，若盐类浓度升高，对细胞产生离子影响(盐害)，即高浓度的的电解质作用于细胞膜，引起脂蛋白复合物的变性和部分类脂质的丢失，增加了细胞膜对阳离子的通透性，在细胞上形成一些小孔，解冻时水分大量进入细胞造成渗透休克。 此时胞内外渗透压在高位相近或相等，随着冷却时间的延长，细胞外液有更多的冰晶，使水分逐渐减少，溶液发生浓缩，对细胞的影响越来越大，原生质变干，电解质浓度增高，酸碱度失衡； 抗冻液的浓度升高，抗冻剂的化学毒性也随之增大，同样导致细胞死亡，这是冷冻对细胞的化学损伤，也称溶液效应（solution effects）。降低温度可以减少盐类和抗冻保护剂对细胞的化学损伤。 为避免化学损伤，冷却过程中应尽快地使溶液降至致命温度以下的低温状态。 （3）低温损伤和低温打击 一些动物品种的卵子或胚胎，在10～20℃情况下则可受到损伤。这与胞质内的脂肪颗粒的含量有关，这种损伤称为低温损伤（chilling injury）。 猪的胚胎在孵化囊胚以前的发育阶段对低温损伤更为敏感，故迄今猪的卵子和胚胎的冷冻保进展缓慢。牛体内受精卵发育到致密桑葚胚前和体外受精卵发育到致密桑葚胚阶段的胚胎，仍可出现低温损伤现象。 但是，体内或体外的胚胎超过上述发育阶段时，几乎不受低温损伤的影响。 低温打击（cold shock） 家畜的精子在室温到O℃之间的温度区域急速降温，使得活率和受精能力下降，这种现象称为低温打击（cold shock）。但卵子和胚胎的这种现象不常见。实验证明，小鼠的受精卵从液氮中直接投入室温的水中反复冻融(2～3次)，仍保持存活率。说明哺乳动物的卵子和胚胎除对低温敏感外，温度变化对其存活的影响不大。 （4）抗冻保护剂的化学毒性 采用慢速冷冻法对胚胎或卵子进行冷冻保存，其冷冻液中所含抗冻保护剂的浓度一般在1.0～2.Omol/L。 添加抗冻保护剂和生理性溶液大不相同，当胚胎或卵子移入含有抗冻保护剂溶液中平衡，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下降。 化学毒性 造成这个结果的原因是抗冻保护剂的化学毒性。另外，化学毒性的强弱不仅与抗冻保护剂的种类有关，同时也受温度高低的影响。 如果使用较高浓度的抗冻液，应选择化学毒性较低的抗冻保护剂，且在室温下对胚胎或卵子的处理时间相对要短。 （5）破裂损伤 液氮中保存的胚胎或卵子，解冻后常见到透明带或部分胞质破裂。 在投入液氮冷冻前的胚胎或卵子，处于浓缩的抗冻液中，投入液氮后溶液由液态变为固态(详见常规冷冻法)。 相变 在解冻过程中使固体变为液体，这种液相和固相急速转换过程中，由于物质的膨胀率和收缩率不同造成断裂，这种现象称作破裂损伤。为防止这种伤害的发生，缓慢通过液体变相温度区域(-110～-130℃)非常重要。 （6）渗透性休克 冷冻胚胎刚解冻时，细胞内通常所含的渗透性保护剂浓度很高，可达2000～3000mOsm/L或更高，若此时将胚胎置于渗透压为300mOsm/L的等渗溶液中，大量水分快速进入细胞而保护剂却不能立即渗出，细胞急剧膨胀甚至破裂，这种现象称为渗透性休克。 细胞对皱缩和膨胀的耐受度 卵子和胚胎不能耐受过大而突然的跨膜渗透压差。 大鼠的合子，在生理温度下，逐渐改变其容积，皱缩到正常体积的25%或膨胀到290%，