淋巴细胞分离.ppt

意义 临床上的各种类型的免疫缺陷、自身免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所显示的功能的强弱进行检测，是判断机体细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等方面均有重要意义。 要求 分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失活性，同时也要求分离技术简单、操作方便。 细胞分离基本原理 不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同 三、淋巴细胞的分离与纯化 贴壁粘附法 磁铁吸引法 Percoll 分离液法 五、细胞亚群的分离 ①免疫磁珠分离法具有高纯度（80?99％），高得率（90?95％）、高细胞活性（99 ? 100%）的特点，仅次或相当于流式细胞仪（FACS）的分选效率。 ②与FACS 相比，本方法操作简单、省时、经济；可用做FACS分选前的预分离，以减少FACS所用时间。 ③另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达95－99％。 注意事项 如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。 分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。 抗体包被磁珠和死细胞常有非特异性结合，因而分选前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞，打散细胞团块。 用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞  ①用FACS分离细胞准确快速、纯度高、回收率高，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行。 ②仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段 六、细胞的保存及活力测定 1、分离细胞的保存? （1）短期保存? 用含有10%~20%灭活小牛血清的 Hanks、RPMI?1640培养液可保存数周（2）长期保存及复苏 保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（-196℃)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬 液，分装于冻存管内，立即放入降温过渡站( -80℃)中，继而进行降温(-196℃)冷冻。 复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 ℃温水中，融化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。 2、细胞活力的检测? 常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）。? 豚鼠的抓取保定 豚鼠性情温顺，胆小易惊，一般不易伤人。捉拿时，实验人员可先用手轻轻扣、按住豚鼠背部，顺势抓紧其肩胛上方皮肤，拇指和食指环其颈部，用另一只手轻轻托住其臀部，即可将豚鼠抓取保定。 兔的抓取保定 家兔驯服不咬人，但四肢的爪尖锐，挣扎时容易抓伤人。抓取保定方法是用右手把两耳拿在手心并抓住颈后部皮肤，提起家兔，然后用左手托住臀部。 另一种方法是使用家兔保定栏。 （1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其钠盐或钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml，市售肝素多为100U~126U／mg。使每ml血液含15U~20U肝素。 （2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一种螯合剂。用生理盐水配制成4％的溶液备用。每ml血液加入1mg~2mg的EDTA。 （3）阿氏液（Alsever液）： 枸橼酸钠（Na3C6H5O7·5H2O） 0.80g 枸橼酸 0.0325g 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g H2O 加至 100.00ml 混匀溶解后，114.3℃高压蒸汽灭菌10min备用。 阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有细胞生存的营养，所以它既可做抗凝剂，又可做血细胞的保存液。 以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液，边采边轻轻摇动采血瓶，使之混匀。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于红细胞的保存。一般在4℃条件下，阿氏液中保存的红细胞2周其活性和特性不变。 三、豚鼠淋巴细胞的分离 采血前的准备 用注射器取3 ml淋巴细胞分层液于一试管中. 再用注射器吸取２ml的阿氏液，并保存在注射器中． 心脏采血 取血前应探明心脏搏动最强部位，通常在胸骨左缘的正中，选心跳最显的部位作穿刺。针头宜稍细长些，以免发生手术后穿刺孔出血。 取豚鼠抗凝血4毫升，加3毫升Hanks液使之稀释。 加于3毫升淋巴细胞分层液液面之上（沿管壁轻轻加入，勿使两液相混）。2000转/分离心30分钟； 用毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单个核细胞，置于含5倍体积的Hanks液的离心管中， 1000r/min离心1