胡萝卜肉质根愈伤组织的诱导及继代增值培养实验报告分析.docVIP

综合性实验报告 胡萝卜肉质根愈伤组织诱导 及继代增殖培养 一、实验原理及目的 （一）实验目的 1、通过MS培养基母液的配制和保存，掌握配制于保存培养基母液的基本技能。 2、通过MS固体培养基的配制，掌握培养基的制备基本技能。 3、学会和掌握诱导愈伤组织的基本技术。 4、初步掌握组织培养的无菌操作技术。 5、初步掌握外植体的消毒技术。 6、掌握组培室常用的化学试剂。 7、学会和掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。 （二）实验原理 1、配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。 2、在自然情况下，根主要为植物吸收和固定的重要器官，同时，有些植物的根亦具有繁殖的功能。植物根生长快、代谢能力强、变异小，使得其在研究根的营养吸收、生长和代谢的变化规律、器官分化、形态建成规律等方面具有重大的理论与实践意义。 依据细胞全能性原理，即指任何具有完整细胞核的细胞（动物、植物等），都拥有形成一个完整个体所必需的全部遗传信息（DNA）。就胡萝卜根来说，其肉质根细胞同样具有形成完整再生植株的能力。这种由单个根衍生而来并经继代培养而保存的，在遗传上具有一致的根的培养物，称为离体根无性系。利用这些离体根的无性系可以进行器官再生体系、苗木无性系快速繁殖和其他方面的实验研究。 3、愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木于接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木与接穗沟通。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁细胞组织而形成愈伤组织。 愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织常用的生长素是2,4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。 愈伤组织形成的过程分为3个时期：诱导期、分裂期和分化期（形成期），愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。 4、调节培养基的酸碱性至PH 5.8左右。由于培养基的PH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都会对植物材料的生长有很大的影响。此外，PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行PH的调整。培养基若偏酸时用氢氧化钠（1mol/L）来调节，若过碱就用盐酸（1mol/L）来调节。当PH值高于6.0时，培养基将会变硬；当PH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。 5、植物组织培养的优点： ①研究材料来源单一，无性系遗传背景一致； ②经济、方便、效率高； ③条件可控、误差小； ④生长快、周期短、重复性强； ⑤可全年试验或生长。 6、继代培养是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养。实际上就是对来自于外植体所增殖的培养物（包括细胞、组织或其切段）通过更换新鲜培养基及不断切割或分立，进行连续多代的培养。 将诱导产生的芽、苗、愈伤组织、原球茎或胚状体等培养物重新分割，接种到新鲜培养基上进一步扩大培养的过程称为继代培养，也称为增殖培养。该过程是植物组织培养中决定繁殖速度快慢、繁殖系数高低的关键阶段。继代使用的培养基对于一种植物来说，每次几乎完全相同。由于培养物在适宜的环境条件、充足的营养供应和生长调节剂作用下，排除了其他生物的竞争，繁殖速度大大加快。 二、实验所需仪器设备及其原理 （一）冰箱 用于长期贮存培养基母液、生化试剂及低温处理材料。 （二）培养箱 用于少量植物材料的培养。有条件的话，还可采用全自动的调温、调湿人工气候箱来进行植物组织培养和试管苗快繁。 （三）超净工作台 超净工作台是为植物组织培养提供无菌操作环境，是最常用、最普及的无菌操作装置，和无菌室相比，超净工作台既方便又舒适，无菌效果又好。 超净工作台一般由鼓风机、过滤器、操作台、紫外灯和照明灯等部分组成。它是将空气过滤后形成无菌的风，创造出一个无菌环境。根据风幕形成的方式，超净工作台可分为水平式和垂直式两种。在一般的植物组织培养中，两种都可以采用，而进行植物的遗传转化操作和农杆菌、大肠杆菌的接种时，最好采用垂直风幕式的超净工作台，这样可以避免细菌在空气中的扩散。 （四）高压蒸汽灭菌锅 高压蒸汽灭菌锅主要用于培养基、蒸馏水和各种器械的灭菌消毒。高压灭菌锅有大型、中型和小型三种。实验室最常用的是中型立式全自动灭菌锅和小型