过氧化实验操作步骤资料.docVIP

材料准备：幼苗培养时选取饱满的种子,经过10%次氯酸钠消毒后,于30℃恒温催芽3天,之后选取长势一致的种子播于96孔PVP板中,并置于盆中(长24cmX宽24cmX高10cm)。在RXZ-500C人工气候箱中进行幼苗培养。培养前1周放入水中培养,于第3周时置于木村B半营养中,于第4周时放入木村B全营养液中,将生长4周的幼苗置于20%PEG-6000中模拟干旱胁迫,分别处理5 h、24 h、72 h,以不进行干旱胁迫营养液培养的幼苗为对照(CK)。为防止根系缺氧,用加氧设备定期加氧。人工气候箱白天温度设定为29°C,夜间设定为27°C,14 h光照/12 h黑暗,光强为220001x。胁迫结束后马上取样,取幼苗所有叶片和根,用银箔纸包好,放入液氮中迅速冷冻,然后保存于-80°C超低温冰箱中储存,用子生理指标的测定。试验设置3次重复,取样时每个品种取一盘,每20株为一次重复。 酶类物质和非酶类物质 1、抗氧化酶活性测定 酶液提取:取样品0.25 g于冰研钵中,加入5 ml预冷的0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.8)(内含5mmol/LEDTA,2 mmol/L抗坏血酸,2%聚乙烯吡咯烷酮),冰浴研磨成浆,在4°C 10000 g下离心30分钟,上清液用于超SOD、POD、CAT和APX活性测定。 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定:釆用氮蓝四唑法(Dhindsa等,1981)。在微烧杯中依次加入1.5 ml, 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.8), 0.3 ml 130mmol/l甲硫氨酸(Met), 0.3ml,750umol/L 氮蓝四唑(NBT), 0.3 ml 100umol/LEDTA-Na2, 0.3 ml 20umol/L核黄素,0.05 ml酶提取液,0.25 ml蒸馏水,反应体积共3 ml。在60 umol photons m-2s-1的日光等下反应20min,同时在暗中和光下分别做2个对照。以暗对照调零,在560nm下测定吸光度,以抑制NBT还原的50%为一个酶活单位计算SOD活性。 过氧化物酶(POD)活性测定:采用愈创木酌法(李合生,2000)。向比色杯中加入0.1 ml酶提取液,然后2.6 ml 0.3%愈创木酚，用0.3 mlO.6% H2O2启动反应,在470 nm下测定连续3分钟内吸光度的变化,用每分钟每克样品鲜重的吸光度的增加值表示酶活性。 过氧化氢酶(CAT)活性测定:参照部琦(2000)的方法,用蒸馏水调零。向比色杯中加入0.2 ml酶提取液,再加入2.8ml0.06mol/LH202启动反应,立即测定240 nm下连续3分钟内吸光值的变化,用每分钟每克样品鲜重的吸光度的降低值表示酶活性。 抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定:参照Nakano和Asada (1981)的方法,用蒸懷水调零。向比色杯中加入0.2 ml酶提取液,1.75ml0.05mol/L磷酸缓冲液(PH7.0),0.3 ml 1mmol/L EDTA,0.3 ml mmol/L抗坏血酸,0.3 ml蒸馏水,用0.3 ml 1 mmol/LH202启动反应,立即测定290 nm下连续1分钟内吸光值的变化,用每分钟每克样品鲜重的吸光度的降低值表示酶活性。 谷肮甘肽还原酶(GR)活性测定:照KnSrzer等(1996)的方法,取叶片0.3 g于冰冻研钵中,力口5 ml预冷的100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5,内含1 mmol/L EDTA),在冰浴上研磨成匀浆,4°C 12 000 g下离心30分钟,上清液即为酶提取液。在比色杯中加入0.2 mL酶提取液,3 ml碟酸缓冲液(pH7.5,含 1 mmol/L EDTA),0.1 ml 5 mmol/L 还原型谷胱甘肽(GSSG),最后用0.03 ml 3 mmol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核昔酸磷酸(NADPH)启动反应,在340 nm下测定连续3分钟内吸光度的变化,用每分钟每克样品鲜重的吸光度的降低值表示酶活性。 脱氧抗坏血酸还原酶(DHAR)活性测定:照Doulis等(1997)的方法,取叶片和根0.2 g于冰冻研钵中,加预冷的提取液(憐酸钾缓冲液Ph7.5,内含ImM乙二胺四乙酸EDTA,0.1 mM聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100,2%聚乙稀吡咯烷酮PVP) 5 ml,在冰浴上研磨成匀浆,4。C 12000 g离心20分钟,上清液即为酶提取液。在比色皿中加入0.2 ml酶提取液,2 ml磷酸钾缓冲液(pH7.O),0.3 ml 25 mmol/L还原型谷耽甘肽(GSH),0.3 ml 1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),加入 0.1 ml2 mmol/L脱氧抗坏血酸DHA)启动反应,在265nm下测定连续3分钟内吸光度的变化,用每分钟每克样品