疾病相关基因的发现及功能@解答.pptVIP

疾病相关基因的筛选及其功能研究 生物体基因表达 多细胞生物的正常生长、发育、衰老以及病理状态下组织细胞的结构与功能的变化，归根结底为基因 在一定时间上 在一定空间上 的选择性表达，即基因的差异性表达 人类基因组及表达概况 人类单倍体基因组由3.2xl06bp DNA组成，含有2～3万个基因 在一般情况下任何类型的细胞大约只表达一部分基因，约产生5 000-15 000种蛋白质 每一特定发育时期或每种组织特异表达其基本与独特的蛋白质 正常成人体内约含有250种以上不同类型细胞 每种细胞大约表达300—400种不同于其他细胞的特异性蛋白质 脊椎动物细胞总蛋白的35％80％在各种组织之间互不相同而构成所谓标志蛋白，也称看家基因 如糖代谢、DNA修饰和蛋白合成等有关酶的选择性表达基因多为低丰度的基因 我们对其中绝大部分基因及表达产物功能尚不了解，在疾病中的意义不明 基因的表达调控 基因的表达主要是通过： 控制转录 转录的启动 转录的速度 转录后的修饰 控制翻译实现 翻译的启动 翻译后的修饰 转录水平：差异性表达mRNA 水平分析 DD RT-PCR技术 差减杂交 抑制差减杂交 基因表达系列分析(SAGE) 翻译水平: protein electrophoresis 转录水平 方法基本要求 寻找mRNA 表达的差异, 至少要满足下列要求 在一定时、空里,约有15 000 种mRNA表达/cell, 除少数属高丰度、大量的属于低丰度表达, 使用的方法足以显示低丰度mRNA 重复性要好 实验过程中能够步步验证比较 得到的产物能代表相应的mRNAs或cDNAs ,并能由此找到相应的cDNA序列 省时,简便易行 A、差减杂交(subtractive hybridization) 差减杂交是利用目的基因在两种组织或细胞中表达的差异，通过其mRNA或单链cDNA进行液相杂交，除去两者之间相同的基因成分取得。 优 点 利用降低了复杂度的差减文库进一步作差异杂交，能够显著提高差异杂交的效率 B、抑制差减杂交(supression subtractive hybridization ,SSH) 原理：以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交方法：利用非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅一柄”结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制非目标序列的扩增 第一次杂交 第一次杂交后有4种产物： a是单链test cDNA b是自身退火的test cDNA双链 C是test和control的异源双链 d是单链control cDNA 目的 第一次杂交是使test单链cDNA均等化，使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致 原 理 丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA. 第二次杂交 合并两份杂交产物，另加上新的变性control单链，再次杂交退火 只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链test cDNA能与control cDNA一起形成各种双链分子 这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA,并产生了一种新的双链分子e，这种分子的两个5端有两个不同的接头，正是由于这两个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效地扩增。 巢式(Nest) PCR 两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式PCR(nested PCR)原理进行扩增 e型分子两端都能和引物配对，扩增效率高 c型的双链分子只在一端有一个引物配对，扩增效率比e型分子低得多 b型分子由于两端有长序列的反向重复，可互补形成牢固的“锅一柄”二级结构，无法进行有效扩增 e就是差异表达的基因 抑制消减杂交法的优点 降低假阳性率 两步杂交和两步PCR，保证了该方法具有较高的特异性 具有高度敏感性：它的均等化和对目标片段的富集，保证了低丰度mRNA也有被检测的可能 抑制消减杂交法的缺点 该方法若是mRNA量不够，那么低丰度的差异表达基因的cDNA很可能会检测不到 其次，消减库中的cDNA因为已被限制酶消化，不再是全长cDNA 步骤繁琐，工作量大 C、限制型差异显示PCR mRNA反转录成双链cDNA 再用同一限制酶(首先识别4bp的酶)消化cDNA 并把酶切片段分别加上接头后进行特异PCR扩增 获得差异表达片段 优 点 通过使用限制酶将cDNA杂交度降低 降低了杂交后无关重复序列对富集的靶序列的污染 假阳性率相对低得多 缺 点 但RDA无法检测缺乏合适内切酶位点的表达序列 类似抑制差异杂交技术，它只能获得较短的靶基因探针，用几个甚至几十个探针分别去筛选全长cDNA绝不是一件容易的事情 另一方面c