实验十一转基因发状根的鉴定3讲述.pptVIP

即用PCR扩增试剂盒 1. 模板DNA和引物的准备： 进行PCR反应，模板DNA的准备非常关键。一般来说，用于PCR反应的模板DNA应高度纯化，不含任何蛋白质、RNA和单核苷酸。这些杂质的存在会降低 Mg2+ 有效浓度，而 Mg2+ 对 Taq DNA聚合酶的活性起关键的作用。 （1）对于基因组DNA，请将模板 DNA浓度调节到0.1~1μg/μl，而质粒或噬菌体模板DNA请将浓度调节到0.01~0.1μg/μl。 （2）将引物的浓度调节到0.1~1μmol/L。 1 影响PCR反应的因素很多，即使使用经高度优化的PCR Master 也会遇到问题。如果发现PCR反应没有得到所需产物或条带较弱，建议用试剂盒中提供的25mmol/L MgCl2 调节反应体系中的Mg2+浓度，以期获得更好的结果。 2 在大多数情况下导致PCR失败的原因是由于加错样或起始反应物不纯，如dNTPs、引物、模板DNA。有些情况是由于模板DNA的降解和引物被脱氧核糖核酸的污染造成。请核对所有溶液和使用起始材料。加样和误算也是一个导致PCR失败常见原因，请仔细检查。 5 若通过上述三步仍然不能解决问题，请检查一下PCR反应体系如下几个主要因素： （1）Mg2+ 浓度 （2）复性温度。如果引物大小是17-25bp，可用如下公式估算他们的Tm 值: