聚合酶链式反应(PCR)基本原理剖析.ppt

聚合酶链反应（PCR） 一、PCR的概念； 二、PCR的基本原理； 三、PCR反应条件的优化； 四、PCR操作的注意事项。 一、概念： 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增技术，即体外试管内DNA的扩增，以高特异性、高灵敏度、高效率及忠实性等特点，在生命科学研究领域产生着巨大的影响。 二、PCR的基本原理 PCR技术实际上是DNA的体外扩增技术。 其原理类似于DNA在体内的复制过程。 反应条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、四种dNTP原料和合适的缓冲液体系，在一定的温度下，经过重复的过程，就可以完成DNA的体外合成。 这些过程都是通过控制温度来实现的，即通过改变温度引起变性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension），使DNA得以复制。 1、变性 通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。 2、退火 将温度降至引物的Tm值左右或以下（比Tm低5℃，通常为55～65℃），引物与DNA模板互补结合，形成杂交链。 3、延伸 在DNA聚合酶（一种耐热的DNA聚合酶）的作用下，于70～74℃以引物3′端为起始点按5′→3′方向使DNA新链延伸。 上述三步为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此经过25－30个循环，可使新生的DNA片段得以扩增。 PCR的反应原理也就是PCR的基本过程。 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR） 三、PCR反应条件的优化 1、引物 引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物，分别与相应的模板链互补。 引物设计遵循下列原则： ①引物长度一般为15～30个核苷酸。 ②引物中碱基的分布尽可能随机，尽量避免多聚嘌呤或多聚嘧啶。 ③引物内避免存在互补序列，以免折叠形成发夹结构。 ④两引物间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补重叠。 ⑤引物与非特异扩增序列的同源性70%。 ⑥引物的3′端碱基一定要与模板互补配对；而5′则可相对不严，甚至还可做一些修饰。 2、PCR的模板 欲扩增的核酸片段是PCR的模板。 可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。 3、耐热的DNA聚合酶 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。TaqDNA聚合酶是目前PCR中应用最广泛的耐热DNA聚合酶。 TaqDNA聚合酶的功能是：以DNA为模板，以四种dNTP为原料，以引物3′端为出发点，按5′→3′的方向，以碱基配对方式合成新的DNA链。 四、PCR实验中应注意的事项 采取以下措施有助于防止污染和结果的假阳性： 1、隔离不同操作区； 2、分装试剂； 3、严格实验操作； 4、严格按无菌操作的原则进行PCR所有操作等。 THANK YOU!