聚合酶链式反应剖析.pptVIP

PCR 的基本原理 其原理类似于DNA的体内复制， 在试管中的DNA的体外合成。 Denaturation（变性） template DNA (dsDNA) —— 95℃±——denaturation ——ssDNA Annealing（退火） Primer（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待扩增的目标片段两端的序列互补。 Extension（延伸） 新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。 尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。 在正常的反应条件下，30次循环，酶的催化反应趋于饱和平台效应 (Plateau) “平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。 PCR反应体系与反应条件 primer 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 2. 保证引物中G-C比例为50%±15%，ATGC最好随机分布。 避免两条引物间或引物内部互补，特别是3’端的互补。 4. length20bp Ta（退火温度）=(4×G/C + 2×A/T – 5 °C ); length20bp Ta=62.3 °C+0.41 °C *(%GC) - 5 °C 保证每个引物的Tm值相匹配。 5. 检测目的DNA序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以帮助避免使用设计不合理的引物对。 (dNTPs) dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总称，是靶DNA 序列扩增的原料。 dNTP浓度根据靶序列的长度和组成而定， 一般使用浓度在50-200umol/L之间 buffer /Mg2+ 常用的缓冲液体系为10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20℃） TaqDNA聚合酶需要游离Mg2+。 PCR反应条件 Analysis of PCR products DNA测序 2.DNA自动化测序 RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 1.RNA preparation 2.Reverse transcription 3. PCR 4. Result Analysis:Quantification or cDNA clone Semi-Quantify RT-PCR 1.RNA preparetion 2.Reverse transcription 3. PCR: a.Target Gene Specified primer b. GAPDH or β-actin primer 4. Quantification PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)限制性 片段长度多态性 1. 分析已知突变 。 2. 突变碱基涉及酶切位点的变化。 PCR 酶切 电泳 单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)的原理及特点 单链DNA片段 复杂的空间折叠构象(主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的) 一个碱基发生改变 影响 其空间构象, 在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 分离构象上有差异的分子. （二）基因异常表达的检测 即检测致病基因的mRNA，在表达水平提供基因功能是否正常的直接证据。可采用RT-PCR，灵敏度更高。 （三）外源基因的检测 适用于细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病。 法医学个体认定 DNA指纹技术建于1985年 英国的遗传学家Jeffreys采用小卫星(20-70bp的寡核苷酸串联重复序列)作探针进行人基因组DNA的Southern blot分析，在一个家系中获得了一张具有高度多态性的DNA图谱，图谱的每一个成员都有各自独特的DNA电泳谱带。 PCR-SSCP SSCP PCR PCR A T C G Wild Amplify region of interested Denature samples in Formamide or Heat A T C G Mutant Denature samples in Formamide and Heat A T C G A T C G DNA molecules conformation depends on their sequence