质粒DNA的提取与PCR精讲.ppt

实验三、四质粒DNA的提取与PCR 2 0 12. 1 0 实验三、质粒的提取与电泳检测 一、实验目的： 1.学习利用碱变性方法提取细菌中的质粒DNA。 2.掌握利用琼脂糖凝胶电泳方法检测质粒DNA 二、实验原理： 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 目前，已发现有质粒的细菌有几百种，绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。相对分子质量一般约为细菌染色体的0.5%-3%, 在1Kb-200Kb之间。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。 当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。 3. 质粒DNA的琼脂糖凝胶检测 DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。 在细菌的细胞内，质粒以超螺旋形式（cccDNA）存在。在提取质粒的过程中，还有另外两种存在形式：线性（linear DNA）和松弛型(ocDNA)。 三. 试剂: ◆溶液Ｉ50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris．Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0) ◆溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS ◆溶液Ⅲ5mol/Ｌ乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml ◆异丙醇 ◆无水乙醇 四.试验步骤: (1)培养细菌:大肠杆菌接种到LB培养基2ml-5ml中,37度振荡培养8-16小时. (2)取培养液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm离心3分钟,去掉上清液，重复收集一次。加入300ul溶液Ｉ,充分吹打混匀后,室温放置5分钟. (3)加入300ul新配置的溶液Ⅱ（100ul NaOH +100ul SDS,用蒸馏水稀释至10ml）,轻柔颠倒5-10次,零下20度放置5分钟. (4)加入300ul溶液Ⅲ,颠倒5-10次,放置5分钟. (5)12000rpm离心15分钟,取上清液（不大于700ul）于一新的Eppendorf管.加入等体积异丙醇,混匀后放置5分钟,12000rpm离心10分钟,弃去上清. (6)用无水乙醇清洗一次,离心管倒置在吸水纸上2min,自然干燥. (7)加入20ul TE 溶液溶解提取物,充分溶解. (8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果. 五、电泳检测试验结果 六、结果分析 思考题: 电泳结果出现几个条带?各是什么? 为什么这一方法被称为碱变性法？溶液1,2,3在其中各起到什么作用？ 实验四、PCR扩增目的基因 实验目的： 1.学习PCR实验操作与原理 2.掌握PCR扩增基因电泳检测方法 二. PCR实验原理 三. 试剂: 1.Taq酶：Mix 2.引物1,2 3.模版：质粒DNA 4.灭菌水 5.0.2ul Eppendorf 管 四.试验步骤: （一）PCR体系： PCR Mix 10ul H2O 9 ul 引物1 0.5ul 引物2 0.5ul 质粒模版 0.5ul (二) PCR循环条件 94℃ 3 min 94℃ 30 s 60 ℃ 30 s 30 cycle 72 ℃ 1 min 72 ℃ 7 min 4 ℃ forever 电泳检测实验结果 * *