胃部细胞中S100A4和突变型p53蛋白相互作用对p53影响及其功能研究S100A4调控胃癌细胞失巢凋亡及其机制研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 影响及其功能研究 刖 罱 胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤。其发生、发展是一个多基因改变、多因 素参与的复杂过程，虽然进行了大量研究，但其分子机制还远不清楚。S100A4是 钙离子结合蛋白$100家族的成员之一，本课题组前期研究并报道了SIOOA4基因 与胃癌的关系，证实S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵 袭力密切相关。但SIOOA4基因在胃癌中的作用机制仍不十分清楚。研究表明 SIOOA4通过与蛋白相互作用及调控下游基因表达发挥效应。2001年首次发现小鼠 乳腺癌细胞中S100A4与突变型p53存在相互作用’。p53是体内重要的抑癌基因 之一，在多种肿瘤组织中可发生p53突变。突变型p53不仅丧失了野生型p53的 肿瘤抑制作用，而且获得一系列类似癌基因特性的功能，其机制与肿瘤细胞中突 变型p53蛋白稳定性增加有关。以往认为突变型p53稳定性增加仅为突变本身所 致，最近研究提示除突变本身外，肿瘤细胞中的分子病理背景如一些蛋白因子会 影响突变型p53蛋白稳定性。目前关于S100A4与突变型p53蛋白的相互作用在 人类肿瘤细胞中尚未得到证实，其相互作用对突变型p53的影响及其意义也未见 报道。因此我们关注于胃癌细胞中S100A4与突变型p53蛋白的相互作用。本研 究中，我们应用免疫荧光细胞化学结合共聚焦检测胃癌细胞内S100A4蛋白与突 变型p53蛋白的表达及定位，免疫共沉淀鉴定S100A4蛋白与p53蛋白的相互作 表达、转录调节及下游靶基因表达的影响，同时检测SIOOA4对细胞分化及自噬等 功能影响。探讨S100A4与p53蛋白相互作用的特点及意义对理解二者在肿瘤发 展中的作用具有重要意义，有助于发现胃癌治疗的新靶点，为肿瘤的靶向治疗提 供新线索和途径。 材料与方法 neo vector；大肠杆菌JMl09感受态 pMDl8-TsimpleVector；pSilenc矗刑4．1．CMV 细胞；SIOOA4 shRNA真核表达载体；pEGFP-C1vector；pCMV-Neo-Barnp53 V143A表达载体。 2、实验方法：应用免疫荧光细胞化学结合共聚焦及免疫共沉淀检测胃癌细胞 blotting及RT—PCR检 中S100A4与突变型p53蛋白的相互作用；通过Western RT-PCR检测SIOOA4沉 测SIOOA4沉默对突变型p53表达的影响；通过Real．time RT-PCR检测共转 默对突变型p53靶基因c—myc、Id2表达的影响；应用Real-time 染SIOOA4 应用染色质免疫沉淀检测SIOOA4沉默对突变型p53转录调节功能的影响；通过碱 性磷酸酶活性检测和GFP-LC3定位分别检测SIOOA4沉默后细胞分化和自噬功能 改变； 构建TP53shRNA真核表达载体，应用Western blotting及RT—PcR检测 TP53基因沉默对S100A4表达的影响。 结果 l、免疫荧光细胞化学结合共聚焦检测显示人胃癌细胞中S100A4蛋白与突 白的相互作用。 过MDM2促进突变型p53蛋白降解，可能影响其蛋白稳定性。 mRNA表达升 3、转染突变型p53(V143A)表达载体后，检测发现c-myc 高，Id2 表达增高，提示SIOOA4影响c-myc、Id2的表达。 5、染色质免疫沉淀实验显示SIOOA4基因沉默后，突变型p53与Id2启动子 结合能力减弱，提示S100A4与p53相互作用影晌突变型p53转录调节功能，进