LSD1抑制剂TCP体外对肾癌786O细胞生物学行为影响.pdfVIP

摘要 摘 要 目的： 初步研究赖氨酸特异性脱甲基酶1( LSD1)抑制剂反苯环丙胺对肾透明细胞 癌786-O 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，并初步探讨其机制。 方法： 1、细胞活力实验：细胞培养成功后行 MTT 实验检测不同浓度梯度下的反 苯环丙胺（TCP ）干预对数生长期的786-O 细胞24h 、48h 和72h 后的细胞生长 抑制率，并设调零孔和对照组，计算 50 ％致死浓度(IC50)，然后绘制浓度-时间 抑制率曲线图；实验重复3 次。 2 、采用流式细胞仪 （Annexin V/PI 双染法）分析、计算细胞凋亡率，并绘 制曲线图。 3、Trizol 法提取实验组和对照组细胞总RNA ，应用分光光度计法检测RNA 浓度、纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性，使用半定量RT-PCR 检测LSD 1 基因mRNA 的表达量变化。 4 、Western-blot 检测实验组和对照组细胞LSD1 蛋白表达量变化。 5、采用划痕试验观察TCP 对786-O 细胞迁移力的影响，拍照观察12h、24h 和48h 细胞迁移距离。实验重复3 次。 6、Transwell 细胞体外侵袭实验检测不同浓度梯度的 TCP 作用对数生长期 的786-O 细胞24h 侵袭到Tanswell 小室下室面的数目，同时设立对照组，予以 0.1 ％的结晶紫染色后拍照。实验重复3 次。 7、数据统计分析：所有数据以均数±标准差( x ±s)表示，采用 SPSS 19.0 统计软件包的单因素方差分析，P0.05 为差异有统计学意义；以P0.01 为差异 有显著统计学意义；以P0.05 为差异无统计学意义。 结果： 1、不同浓度(0、10、20 、40 、80、160 和320uM)的TCP 作用于786-O 细胞 24h 、48h 和72h 后，MTT 法检测结果显示，1‰的DMSO 溶液对786-O 细胞无 影响，TCP 对786-O 细胞的增殖有抑制作用，10uM 以上随药物浓度的增大、作 用时间的延长，抑制作用随之增强，呈现明显的时间-剂量效应关系(P ＜0.01) 。 计算出24h 、48h 和72h TCP 的IC50 值分别为 133.76uM、67.66uM 和36.02uM 。 II 万方数据 摘要 2 、流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI 双染法检测药物诱导细胞凋亡分析表明， TCP 作用肾癌786-O 细胞48h ，0uM 组、DMSO 组和 10uM 组两两比较，凋亡 率无统计学差异（P ＞0.05 ），40uM-160uM 组随浓度的增高，早期凋亡和晚期凋 亡细胞的比例都逐渐增加，与对照组相比差异具有显著统计学意义(P＜0.01) 。同 时，细胞坏死率也同步增高，说明TCP 具有细胞毒性作用，随药物浓度增高， 毒性随之增大； 3、TCP 处理786-O 细胞48h 后LSD1 基因mRNA 表达量的分析，40uM 和 80uM 组的表达明显低于0uM 组及1‰DMSO 组LSD1 基因mRNA 表达量（P ＜ 0.01 ）； 0uM 组与1‰DMSO 组比较，结果无明显差异（P ＞0.05 ）； 4 、Western-blot 分析TCP 处理细胞48h 后LSD1 蛋白在786-O 细胞中的表 达情况， 40uM 和80uM 组的表达明显低于0uM 组及 1‰DMSO 组LSD1 蛋白 表达量（P ＜0.01 ）