选修一5-3血红蛋白的提取和分离导论.ppt

装配好的凝胶柱 开始进行层析 收集得到的纯化后的蛋白 材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填: 2.凝胶色谱柱的装填： 步骤 操作要求 ① ② ③ ④ ⑤ 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 洗涤平衡 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 装填悬浮液 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间 的空隙。 3、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气 泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物 质的分离效果。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 3.样品的加入和洗脱 3.样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 * * * 专题5 DNA和蛋白质技术 * 我们可从鸡血中提取得到DNA，DNA到底有着怎样的特性？ 假如想提取得到蛋白质（如血红蛋白），我们能成功吗？蛋白质有没有什么特性呢？该用什么动物的血呢？ 课题3 血红蛋白的提取和分离 一. 蛋白质分离的原理和方法 1、蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性（理化性质）的差异： 分子的形状、大小 电荷性质和多少 溶解度 吸附性质 对其他分子亲和力 来分离不同种类的蛋白质。 凝胶色谱法：又称分配色谱法 电泳法 2、蛋白质提取和分离的方法： （一）凝胶色谱法 1、概念： 也称分配色谱法，根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2、凝胶的基本知识： 凝 胶 形态： 组成： 结构： 微小多孔的球体 大多是由多糖类化合物形成 如葡聚糖、琼脂糖 内含许多贯穿的通道 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较小 相对分子质量较大 凝胶内部的通道 容易进入 无法进入凝胶 内部的通道 在凝胶外部移动 路程较长 移动速度较慢 路程较短 移动速度较快 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 3．凝胶色谱法的原理 调节缓冲剂的 就可以制 得在 使用的缓冲液。 通常由 种缓冲剂溶解于水 中配制而成的溶液。 1．缓冲溶液：（ 1．什么是缓冲溶液？） 1～2 2．缓冲溶液的作用：（2．缓冲溶液的作用是什么？） 3．缓冲溶液的配制：（3．缓冲溶液是如何配制的？你所学过 的人体血浆缓冲物质有哪些？） 在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持溶液pH基本不变。 使用比例 不同pH范围内 （二）缓冲溶液- 可做洗脱剂 使用的是20mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲液。 目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色） 和材料的科学研究（活性）。 4．血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲溶液：（4．在血红蛋白的提取和分离实验中用的 缓冲溶液是什么？它的目的是什么？） 思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 （三）电 泳 1、概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2、原理： ◆ 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 ◆ 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具 有可解离的基团，在一定的