抗体分子改造.pptVIP

目的基因表达的蛋白如若想在噬菌体表面呈现，就必须插在这5种外壳的其中这一处。实验表明，在gp6、gp7、gp9中插入外源蛋白，都会影响其构成外壳蛋白的功能，而在gp8和gp3的N端插入外源蛋白后，形成的融合蛋白既可在噬菌体表面呈现，也不影响噬菌体的完整性和稳定性。 * 成熟的gp8含有50个氨基酸，从构成外壳的功能来看可分为4个部分： （1）C端15个氨基酸偏碱性，与DNA相结合，构成外壳的内壁，在此处的突变将影响与DNA的相互作用。 （2）25～35位肽段具有高度的疏水性，借此特性分子间相互聚合，形成固牢的外壳。这段肽链的改变将会影响噬菌体结构的稳定性。 （3）从第6位的脯氨酸到C末端是连续的α螺旋结构，6～24位的螺旋肽段外露，在外壳上排列紧密，占据了噬菌体的大部分表面。如有稍大肽段插入，将会影响外壳的稳定性。 （4）N端1～5位的氨基酸序列是丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-门冬氨酸-门冬氨酸（A-E-G-D-D），它外露于噬菌体表面，是外源肽段插入的最佳位置。 * * 利用这一系统可以构建表达性基因文库，称为噬菌体呈现文库。它最先被用于抗体基因文库的构建和筛选。虽然利用动物的免疫可以获得循环多克隆抗体，用细胞融合方法可以获得单克隆抗体，但利用基因工程的技术构建抗体基因库，再筛选所需的特异性抗生，不仅摆脱了繁重的工作量，也可获得大量的、稳定的抗体。而且随着研究的不断深入和发展，抗体的多样性，亲和力也大有提高。 * 在构建噬菌体呈现抗体文库技术中，主要有3个特点： （1）可用抗原制备出免疫吸附剂，将文库的噬菌体与其反应，再经洗涤、洗脱得以捕获和纯化，将这种表达所需的特异性抗体的噬菌体感染大肠杆菌而得到繁殖。如此经过亲和结合→洗涤→洗脱→繁殖的富集过程，称为“panning”（淘选），一轮paning便可富集1000倍。如此简便、高效率，是其他方法比似的。 * （2）亲和力成熟过程可由体内转为体外。如前所述，抗原物质对动物机体的再次免疫，可获得高亲和力的抗体。这种在体内出现的亲和力成熟的现象，是由于细胞抗体基因在CDRS区域突变，再通过表面呈现技术加筛选，便可获得亲和力的特异抗体 * （3）这种方法不仅可以获得单链抗体，也可制备出重链、轻链结合的抗体（Fab）片段。 外源基因编码的肽段在融合蛋白的N端，呈现在噬菌体表面时，C端锚着在膜上，N端是游离的，能够正确折叠，也可以形成二硫链。 如果在插入基因与编码成熟gp8序列间放置amber终止码（TAG），则TAG就是蛋白质合成的终止信号，合成的多肽以非融合蛋白的形式分泌在内膜与细胞壁间的周质中，进而还能进入培养基中。利用这些特性，可将Fc蛋白锚着于细胞膜上，在周质中的分泌的轻链分子可与重链原位组装。形成完整的Fab片段积累在膜表面。 * 第七节 抗体分子的改造和基因工程 自1975年Catton 和Milstein等研究制造出单克隆抗体（MAb）技术以来，获得了迅速的发展和极为广泛的应用。但也确实存在不少难以克服的问题，如绝大多数的Mab是鼠源性的，对人有较强的免疫原性。如果用于人的治疗，不出2周就会产生人对鼠血清的免疫应答，患者体内存在的人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody, HAMA），不仅降低了疗效，严重的可引起患者出现血清病。 * 随着分子遗传学、生物化学、特别是分子生物学的发展，人们开始着手利用DNA分子重组技术，改造和生产所需要的特异性单链抗体、免疫粘连素、超变区多肽，直到用丝状噬菌体表面呈现技术构建和筛选抗体基因文库。 * 一、双特异性抗体 免疫球蛋白分子具有重链、轻链组成的4条肽链结构，它们共同组成2个抗原结合点。由于2个结合点的抗原特异性相同，故表现为单一特异性。 * 双特异性抗体是将2个结合点表现为不同的特异性，抗体的一个结合点的特异性表现为靶细胞（如肿瘤细胞）结合，另一结合点可与药物（如蓖麻毒素、抗癌药物、细胞毒性细胞）结合。 * * 这种双特异性的结合，可使作用物直接地、高密度地作用于靶细胞，提高了疗效，从而可相对地减少对患者的副作用。 * 制备双特异性抗体的方法主要有3种方法： （1）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的Mab细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体。 * 它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有10种形式： 重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗体分子： LH-HL，KG-GK 重链特异性相同的配对抗体分子： LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重链、轻链特异性不同的配对