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第四章 基因工程概论 目的 了解基因工程的概念及研究的内容 ?内容 基因工程的概念、基本步骤、载体-宿 主系统、工具酶与基因工程、目的基因 的制备、分子克隆建立和目的基因表达 重点 工具酶与基因工程、目的基因的制备 ?难点 分子克隆的建立和目的基因的表达 学时 3 第一节、基因工程的概念 一、基因工程的概念 基因工程也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另—种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖(称之为“克隆”)和行使正常功能(称之为“表达”)，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 —股说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体系统的DNA结合成—个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。 二、基因工程的基本步骤 基因工程的基本内容是有目的地对遗传物质功能单位进行综合，创造有价值的生物分子或新的动物、植物或微生物品系。基因工程的基本步骤主要有包括： ①??? 目的基因的制取； ②??? 基因载体的选择与构建； ③??? 目的基因与载体DNA的拼接； ④??? 重组体分子导入受体细胞，筛选和无性繁殖(克隆) ⑤??? 外源基因的表达和产物的分离纯化。 第二节 载体-宿主系统 理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： ①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。 ②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 ③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这要求载体DNA有合适的限制性核酸内切酶位点。 ④容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。 ⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。 常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。 一、质粒载体 质粒是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。 质粒特点 ①是染色质外的双链共价闭合环形DNA，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300 kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。 ③质粒对宿主生存并不是必需的。 质粒分类 按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制型质粒和松弛控制型质粒 严紧控制型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝； 松弛控制型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。 二、噬菌体载体 噬菌体是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，如λ噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 λ噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖： ①溶菌性方式：在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，λDNA经多次复制合成许多子代λDNA，于是装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。 ②溶原性方式：进入细菌的λDNA可整合入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌。λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。 λ噬菌体整个基因组，可分为三个部分， ①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。 ②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。 ③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 三、动物病毒载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感