第二章生物催化剂的发现13总结.ppt

2.1 概述 2.2 微生物酶筛选的策略 2.3 微生物和酶的一般筛选方法 2.4 优良菌种选育 2.5 从环境中微生物基因组DNA筛选酶的方法 2.6 生产用菌种的保藏 2.1 概 述 2．1．1 生物催化剂的概念 1 生物催化剂：是生物反应过程中起催化作用的游离或固定化酶的总称。 2 分 类 结 构 形 式 细 胞 酶 多细胞生物体 游离型催化剂 固定化催化剂 酶或产酶微生物的筛选 一般产酶微生物筛选的原则 ①能够通过发酵在相对较短的时间内高产目标酶； ②微生物应该尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶； ③微生物所产生的酶最好有比较高的专一性 ④所采用的微生物应该是不产生有害物质的非致病性的安全微生物 ⑤微生物的遗传稳定性应该比较高 生物催化剂筛选的主要途径 （1）从商品酶库中筛选 （2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选生物催化剂 （3）从自然界发现和筛选产酶微生物 （4）从基因库筛选 建立有效和方便的筛选分析方法 2．2．2 从极端微生物中筛选极端酶的策略 极端酶（extremozyme） 是由极端微生物（extremophile）产生的酶，与之相对应的中间型是常态微生物（mesophilic organism）产生的酶。 而极端微生物是在极端条件(-2～15℃，60～110℃，离子强度达5mol／L NaCl，pH＜4或pH≥9)下生存的微生物．它们所产生的酶在相应的极端条件下也具有较高的稳定性。有的极端微生物，特别是属于古细菌(Archaea)的菌种中，存在新的代谢途径，可能产生具有新的催化活力和用途的酶。经鉴定过的绝大多数极端微生物属于古细菌类，属于中间型的古细菌也有发现。 2.2.3 未培养生物催化剂的发现策略 未培养微生物（uncultured microorganism） 美国微生物学家Colwell的实验室在1982年首先提出“不能培养微生物（nonculturable microorganism）” 的概念，他们发现快速生长的霍乱弧菌和大肠杆菌移植到无营养料的盐水中，经长时期的低温保存后，细胞数不减，代谢活力不变，但在正常肉汤培养条件下不产生菌落，因此他们用“活的但不能培养（viable but nonculturable, VBNC)”一语描述这种潜伏状态的细菌。 微生物资源研究和开发领域里的一个重大探索就是，可以采用最新的分子生物学方法，绕过菌种的分离纯化这一步骤，直接在自然界中寻找有开发价值的微生物基因。把来源于未经培养的微生物的DNA克隆到经培养驯化的宿主生物体(即可培养微生物，多用大肠杆菌)中，然后用高通量筛选技术从重组的克隆里筛选为新酶编码的基因。未培养微生物的发现又被称为分子筛选(MolecularScreening)。 2．3 微生物和酶的一般筛选方法 2．3．1从自然界发现产酶微生物 采样 富集培养：是根据微生物的生理特点，在目的微生物含量较少时，设计一种选择型培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣种变成人工环境下的优势种。分为分批式（摇瓶培养）和恒化式（连续培养）两种不同的方式。 分离 筛选（初筛和复筛） 图2-2 从自然界发现产酶微生物的方法 富集培养方法可采用分批式（摇瓶培养）和恒化式（连续培养）两种方式。分批式培养，转种的时间是关键。恒化培养通过改变限制性基质的浓度来控制两类不同菌株的比生长速率，通过改变稀释速率进行连续富集培养，特别适合连续发酵生产。 多糖产生菌的筛选:取样特点：碳水化合物工业的废弃物筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。 氨基酸产生菌的筛选 样品 ? ? 预处理 ? ? 初筛（除真菌） ? ? 在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法） 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到copy前相应 u.v线杀死长好的菌落 位置，找到目的菌落 再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈 ? ? 目的菌落进行液体培养， 对产物进行定量测定 筛选产物含量高的菌株 纯种培养 一类为工业生产中应用较多的稀