第5章基因组序列诠释5+1强伯勤解说.pptVIP

第五章 基因组序列诠释 问 题 基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？ 基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？ 1. 寻找基因 1.1 根据开放读框预测基因 ⑴ 起始密码子 ATG 第一个ATG的确定(依据Kozak规则); Kozak规则是基于已知数据的统计结果. 所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律. Kozak规则: 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下： (1)第4位的偏好碱基为G； (2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 信号肽分析软件 (SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把预测过程中证实含完整mRNA 5’端的序列翻译为蛋白序列; 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽; ⑶ 终止密码子 ⑷ 3’端的确认 ⑸ 非编码序列、内含子 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。 不同种属间使用同义密码的频率有很大差异： 如人类基因中， 丙氨酸（Ale）密码子多为GCA,GCC或GCT,而GCG很少 苏氨酸（Thr）密码子多为ACA,ACC或ACT,而ACG很少 ⑺ 密码子偏爱性 ⑻ 外显子－内含子边界 ⑼上游控制序列 ⑽ 内含子和外显子序列差异 ⑾ 软件预测 采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi )判断ORF的可能范围。 基因注释软件 Genscan ——重于信号指令：起始密码、终止密码、剪接受体位和供体位序列等 FgeneSH ——重于内容指令：密码子使用偏好、内含子外显子的差异等 TWINSCAN和SGP2——根据相似性和一致性 基因注释软件缺点 外显子注释的准确率 80%。 误拼和误拆错误较多。 容易忽略结构较小的基因，特别是基因内基因。 1.2 同源查询途径 通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。 相似性有如下几种情况： A DNA序列某些片段完全相同； B 开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子； C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性； D 模拟多肽高级结构相似 同源性：homology起源于同一祖先但序列已经发生变异的序列，分布在不同物种间的同源基因，只有是与非的区别。 分子杂交可确定DNA片段是否含有表达顺序 Northern blot：指将待测DNA样品标记后与RNA杂交，以判断RNA中是否含有DNA的转录产物。但在操作中存在一些问题 C 基因表达产物丰度的问题 DNA顺序中基因位置的确定 cDNA测序受两个方面的影响： 一是相关cDNA在cDNA文库中出现的频率； 二是cDNA的完整性 如何获取基因全长cDNA序列？ 干扰cDNA筛选基因的因素： 目标cDNA所占比例很低 分成亚群进行筛选 cDNA均一化 影响cDNA测序的因素与mRNA的反转录有关 确定DNA顺序中基因的位置 A 通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域； B 通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置； 2、基因功能的预测 利用计算机分析基因功能 2.1 同源性确定基因功能 ??种间同源基因或直系基因（orthologous gene）：指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分化以前的共同祖先 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸序列，因为不同的基因或不同的生物都会独立地发生随机突变，但它们有相似的序列，大部分未突变的核苷酸位置是相同的 同源性分析可以给出整个基因或其中某一区段功能的有关信息 2.2 同源性分析在酵母基因组计划中的应用 酵母基因组大约含有6000个基因 30％是通过传统遗传学分析得到的 另外70％是用同源性分析获得 3、实验确认基因功能 3.1 基因失活在基因功能分析的作用 3.2 基因的超表达用于功能检测 3.1 基因失活在基因功能分析的作用 3.1.1 基因剔除(knock-out) 最简便的基因失活的方法