单克隆抗体研究进展解答.pptVIP

生命科学学院 遗传学 冯 刚 2.单克隆抗体制备的基本原理 3.单克隆抗体制备过程 4.研究进展 4.2人源化抗体 不足：由于具有支持作用的FR不仅为CDR的构象提供了环境，还参与抗体结合位点正确构象的形成和抗原的结合，常常使得CDR移植抗体的亲和力和特异性大大降低，有的甚至还丧失了抗原结合能力。 4.2.3全人源化抗体 特点：实现了直接将基因型和表现型完美的结合在一起， 可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性的抗体。 存在的问题： (1)抗体亲和力相对较弱; (2)抗体多样性无法满足。 (2)转基因小鼠技术 4.3核糖体展示技术 我国单克隆抗体药物研发进展情况 目前，我国的单克隆抗体产业已经形成了以北京、上海、西安以及武汉等产业化基地。而单克隆抗体也发展到了第四代，我国已经上市的单抗药物多为鼠源性，正在研究中的多为嵌合或者人源化单抗，而全人源单抗还没有。而在全球的单克隆抗体市场，全人源化单克隆抗体是其未来的发展方向。在FDA批准上市的80多种基因工程和抗体工程产品中，抗 体类产品有26种，其中18种为人源化抗体。 * * * * 抗体(antibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。 单克隆抗体(monoclonal antibody)是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。 特点：1.高特异性；2.高均一性；3.高单一性。 1.定义： 1975年，淋巴细胞杂交瘤技术由Kohler和Milstein建立。 致敏B淋巴细胞( sensitized B cells ) (能够分泌特异性的抗体 ，不能在体外长期生存) 骨髓瘤细胞(myeloma) (不能分泌特异性的抗体，但能在体外长期生存) 1 2 × 阳性杂交瘤细胞(hybridoma) 克隆化培养 （产生单克隆的阳性杂交瘤细胞） 2 1 2 2 2 单克隆抗体 1 生产单抗 4.1鼠源性抗体 主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。 不足：鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)，这在很大程度上限制了mAbs的临床应用。此外，鼠源性的mAbs不能与人类抗体FcRn结合。 技术：B淋巴细胞杂交瘤技术。 4.2.1嵌合抗体指的是鼠mAbs的恒定区基因被人Abs的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码产生的单克隆抗体。这样既能保持鼠单抗的特性，又使获得的单抗降低了在人体内的免疫反应。 4.2.2CDR移植抗体，又称改型抗体，是在嵌合抗体的基础上，利用基因工程技术，进一步用人的FR代替鼠FR，形成的只剩3个鼠源CDR的、更为完全的人源化抗体。 主要包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体。 解决方案：选用与鼠源单抗具有高度同源性的人源抗体，但保留鼠源单抗中的一些关键氨基酸残基，并在此基础上，对鼠CDR和FR的一些表面氨基酸残基进行修饰或重塑，对关键氨基酸残基进行一定的改变，能在保留CDR移植抗体的亲和力和特异性下，大大降低其免疫原性。 优点：人源化程度能达到70%以上， 有利于其在临床试验中的应用与研究。 制备方法：噬菌体展示技术和转基因小鼠技术。 (1)噬菌体展示技术 基本原理： 将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因通过基因工程技术随机插入噬菌体的外壳蛋白基因，继而感染大肠杆菌，经增殖并以抗体片段Fab或ScFv外壳蛋白融合蛋白的形式展示在噬菌体表面；利用靶分子，经过“亲和-洗脱-扩增-亲和”循环过程筛选，除去杂蛋白并富集特异性抗体。 目前已建立的噬菌体展示系统，如：丝状噬菌体、l噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体和真核病毒系统等。 该技术至今还未发展完全，其转基因片段较小，且相邻基因片段高度同源，重组过程复杂，在面对抗原多样性时，无法完全产生相应的抗体。 基本原理：利用PCR 扩增含目的基因的cDNA 文库，再加上启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译偶联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物，用相应抗原反复筛选复合物，分离mRNA，通过RT-PCR 富集目的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。 存在的问题： 1.mRNA 易降解。 2.“蛋白质-核糖体-mRNA” 三元复合物的稳定性也较差。 解决方案： 1.目前已有研究表明，氧钒核糖核苷复合物(VRC)作为过渡阶段的类似物发生作用，可有效地抑制核酸酶，提高mRNA的稳定性。 2.在缓冲液中加入