体内药物第七章免疫法分解.ppt

第七章 免疫分析法 一、基本原理 抗原－抗体反应须满足以下条件： (二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线) (三)抗原一抗体反应的特点 2．可逆性 3．最适比例性 二、基本条件 2．人工抗原的制备 (3)载体与半抗原的结合 4．标准抗原(Standard antigen) (二)特异抗体的制备及鉴定 2．抗体的制备 (1)免疫原的制备 (2)免疫接种动物 (3)抗血清的获得 3．抗体的鉴定 (2)活度(Avidity) (3)特异性(Specificity) 三、方法分类 2．按是否加入分离剂分 第二节 放射免疫分析 一、放射性同位素标记抗原 1．放射性强度 2．放射性比度 3．放射性化学纯度(放化纯度) (二)标记抗原(Iabeled Antigen) 1．对标记抗原的一般要求 2．标记放射性同位素的选择 (三)标记方法 2．3H标记抗原的制备 二、F与B的分离技术 (二)吸附法 (三)固相法 (四)双抗体法 三、放射免疫测定仪 (一)测量原理 1．溶剂 2．闪烁剂 (二)仪器简介 1．计数瓶 2．光电倍增管 3．记录器 四、标准曲线的制备与样品测定步骤 (一)标准曲线的绘制 (二)样品测定步骤 例：125I－RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度 五、方法评价 六、应用示例 3．结果计算 (2)回归方程计算法 第三节 酶免疫分析法 一、酶标记抗原 最常用的标记酶 (二)底物的选择 常用酶的底物 二、均相EIA (一)测定原理 (二)测定方法 三、非均相EIA (一)测定原理 (二)测定步骤 四、方法评价 五、应用示例 取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5－8个系列浓度。 加入定量标记抗原，其总放射性(T)应能满足准确测量的需要。 加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求。 将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率(T)。 加入分离剂，使结合部分(B)与游离部分(F)分离。 测定各管结合部分或游离部分的计数率。 标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标，以结合率(B％)为纵坐标作图。 纵坐标B％的计算有两种方法：一种是将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较，即B％=(B／T)×100％；另一种是用零标准管(不加药物标准品)的放射性强度B0代替T比较，即B％=(B／B0)×100％。 下述情况样品需进行简单处理： 测定方法不够灵敏，可将被测物适当浓集； 测定方法不很专属，可将被测物与其它干扰物质分离； 待测物以缀合物形式存在，可设法使其游离，然后进行测定。 待测血清样品50μl→样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50μl→标准曲线各管中;50μl 空白人血清→零标准管.各管中依次加入保温液100μl→抗体溶液100μl→125I标记的地高辛(溶液)100μl摇匀→在室温(15～25℃)放置30min→γ-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)→在电磁搅拌(或手摇)下，迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内)，摇匀→离心10min(3000r/min)→倾去上清液→γ-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率。 灵敏度高、特异性强、取样量少、适用于大批量样品的测定。 需用放射性同位素标记抗原，其放射性对操作人员的健康、对环境的污染都会造成危害，而且还需有专用的同位素实验室及免疫测定仪器，成本较高，因而使其普及受到限制。 固相放射免疫分析试剂盒测定血清中地高辛 浓度的方法 1．主要试剂 2．测定方法 (1)标准曲线法 以地高辛标准品血清浓度为横坐标，B标／T(％)为纵坐标，在半对数坐标纸上绘出标准曲线。。 以地高辛标准品血清浓度为横坐标，但用(B标-BNSB)/(B0－BNSB)(％)为纵坐标作标准曲线，当测得血清样品的(B样－BNSB)/(B0-BNSB)(％)值后，也可从标准曲线上得到对应的血清药浓 以logx为自变量(x为血清中地高辛标准品的浓度)，以logitY为因变量进行直线回归 酶标记抗原 均相酶免疫分析 非均相酶免疫分析 方法评价 应用示例 酶免疫分析(Enzyme Immunoassay，EIA)是以酶作为标记物的免疫测定方法。酶免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的基础上发展产生起来的一种新的免疫分析方法。 (一)标记酶的选择 特异性强，酶蛋白分子中应具有足够的活性基团，以便能与药物结合。 活性要高，即当底物浓度低时，确有较高的催化反应率。 酶的活性不易受样品中其它成分影响，有较好的稳定性。 酶的纯度要高，且生物体液中应无标记酶、底物、抑制剂及其它干