目的基因的获得精讲.pptVIP

基因工程技术（三） 基因工程技术又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。 所以目的DNA片段的获得是进行DNA重组的前提。 基因工程技术又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。 所以目的DNA片段的获得是进行DNA重组的前提。 （一）DNA片段的获得 1、从基因所在的生物体直接取得 限制性内切酶（restriction enzymes） 2、人工合成DNA片段（DNA合成仪） 3、PCR反应合成DNA 4、 mRNA反转录成cDNA 5、用机械的方法 超声波、 （二）DNA片段和载体的连接——重组体DNA 载体：细菌中的质粒、温和噬菌体 重组体DNA：载体DNA+引入的DNA 粘性末端 平整末端 连接酶 目的基因的表达 目的基因在插入载体后，在其编码顺序的5’端有能被受体细胞识别的启动基因顺序及能和核糖体结合的顺序。则该目的基因就可以表达，从而使是因工程得以实现。 1.基因工程用于生产蛋白质类药物 治疗糖尿病的胰岛素，是一种 51 个氨基酸残基组成的蛋白质 1982 年美国 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。 干扰素用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗效。 1 升发酵液中所得的干扰素相当于过去从 1000 升人血中所得。生产成本也大为降低。 目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前本不可能大量生产的生长因子，凝血因子等蛋白质药物，现在用基因工程办法便可能大量生产。 * * 获得目的基因的方法 前言 方法一：直接从细胞中提取、酶切 特点： （1）、如果从基因组DNA获取目的基因 相对于目的基因的长度，基因组的DNA长度太大。 （2）、从染色体以外的遗传物质中获得目的基因是常用的做法 方法二、化学合成法 人工合成寡聚核苷酸技术：60bp 1.2元/bp 在60bp与120bp之间 6.8元/bp 提供DNA合成服务的公司： 上海生工生物工程有限公司 上海英俊生物科技有限公司 上海华诺生物科技有限公司 北京奥科生物技术有限责任公司 等 特点： 1、 合成的产物是单链DNA 2、 5’、3’末端均为羟基 3、应用场合： 真核生物基因在原核中表达； 难以得到模板的情况； 获得双链的方法： （1）、3’末端部分反向互补，混合后在DNA聚合酶作用下互为模板形成双链 （2）分段合成法 OH，先用激酶处理，使磷酸化 连接酶 OH，先用激酶处理，使磷酸化 （3）、分段合成，结合PCR技术 PCR 方法三、PCR技术 （1）、直接从原核微生物细胞或质粒中扩增目的片段 （2）、引入突变 a、引物5’端引入 b、定点突变，SOE技术 c、易错PCR 方法四、RT-PCR技术 针对真核生物基因不连续的特点，利用mRNA为核苷酸信息资源，用逆转录---PCR法获得目的基因 AAA…AAA 3’ 5’ T T T…T T T Complimentary DNA RT：Reverse Transcriptase Summary: 1、细胞中提取； 2、化学合成； 3、PCR技术； 4、RT-PCR 前言 粘性末端、平整末端 200多种限制性内切酶，切点各不相同