酶的分离、纯化技术.pptVIP

本章重点 各种分离方法的操作原理 分离方法的应用原则 酶分离纯化中应注意的问题 酶制剂的来源 3.1 酶纯化的必要性 3.2 起始材料的选择 3.3 酶的萃取 3.4 分离方法 3.5 酶纯化步骤的设计 3.6 纯化步骤的定量评价 3.7 在纯化过程中酶活力的损失 3.1 酶纯化的必要性 生物细胞中同时存在多种多样的酶。 酶在生物细胞中的分布并不是均一的。 许多酶可能作用于同一个底物。 3.2 起始材料的选择 不顾及酶的来源时，可选择酶含量高的材料。 微生物培养物 注意材料的年龄 注意在生物体内的富集区域 3.3 酶的萃取 （处理液应及时处理，否则在均浆上加一薄层甲苯可以防止微生物感染。） （1）膜和细胞壁的破碎：研磨、超声波、高压（注意胞外酶的测定） （2）酶的萃取：萃取液3倍于起始材料 缓冲液(pH 7.5)的作用，中和从空泡中放出的大量酸；高离子强度(0.1-0.5)有助于将酶从结合的膜上解析下来；丙酮粉有助于将酶与脂肪或磷脂膜分离。 注意事项：蛋白酶的抑制方法（低温快速、抑制剂） 制备丙酮粉用以解除酶与脂肪或磷脂膜的结合。 除去核酸：调整pH沉淀（鱼精蛋白硫酸盐或链霉素）、水解 3.4 酶的分离方法 （1）以大小或质量为依据：离心（300000g)、凝胶过滤（Sephadex交联葡聚糖、Bio-Gel交联聚丙烯酰胺）、透析、超过滤 （2）以电荷为依据：离子交换色谱（低离子强度、适当pH）Sephadex、DEAE-纤维素、CM-纤维素；电泳（电荷、分子大小、分子形状）纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置） （3）以溶解度变化为依据：改变pH、改变离子强度、降低介电常数 （4）以特异性结合位置为依据：亲和色谱、亲和洗提 （5）其它方法：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性的非离子聚合物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩 分离方法分解 (1)以大小或质量为依据 离心 凝胶过滤 透析和超过滤 1.1 离心 原理：以质量不同为分离依据 离心力5000-50000g 处理量可达几升 分离对象:细胞碎片、沉淀下来的酶 高速离心 速度一般在20,000以下。 超离心 相对离心力场速度在75,000 g以上，在80,000~250,000 g 之间。主要分离小分子量酶。 沉降速度, 离心法（区带离心法），等密度梯度离心法（沉降平衡法）。 1.2 凝胶过滤 原理：不同大小的分子进入颗粒状凝胶内微孔的能力不同，能进入微孔的小分子被阻滞，不能进入微孔的大分子未被阻滞。 换句话说，分离是因为不同分子在进入或不进入凝胶所经过的路程不同而达到分离的目的。 其他名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻层析 Sephadex(交联葡聚糖）、Bio-Gel(交联聚丙烯酰胺） 酶后期处理（小量试样） 葡聚糖凝胶操作流程： 1）选择 根据分子量大小范围选择凝胶。 凝胶 如:G50排阻1,500-30,000 （Sephadex） 还有粗，中，细分，细的分辩率高,流速慢；粗的分辩率低,流速快。 2）溶涨 水浸或沸水煮，快而可以杀菌，防止微生物污染。 3）装柱 不能有气泡，用缓冲液平衡 4）上样 按柱床体积计算约1/ 40左右。 然后用缓冲液洗脱。注意流速。 5）再生 稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微 生物生长，加0.02% NaN3 使用时要注意可能抑制你要分离的酶。 聚丙烯酰胺凝胶 丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合而成。 Bio-Gel P-2 数字后面乘1000表示最高排阻分子量 分离生物大分子的范围与葡聚糖凝胶 基本相同 琼脂糖凝胶 是琼脂去除琼脂胶后得到 D-半乳糖和6-脱水 Sepharose 半乳糖相间排列而成。 如：4B即琼脂糖含量占4% 。 另外的商品Bio-Gel A是琼脂糖与丙烯酰 胺交联而成。Bio-Gel CL，比上述二种 化学稳定性和机械强度更好，应用更大。