饲料中黄曲霉毒素的测定.doc-安徽省兽药饲料信息网.docVIP

古老ICS目 次 目 次 I 前 言 II 1 范围 1 2 方法原理 1 2.1 试剂和溶液 1 2.2 仪器和设备 1 2.3 分析步骤 2 2.4 测定 2 前 言 本标准由安徽省饲料工业标准化技术委员会提出。 本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所。 本标准自200X年XX月XX日首次发布。 本标准主要起草人：张莉、丁在亮、刘红云、刘发全。  饲料中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化-荧光光度法 范围 本标准规定了免疫亲和层析净化一荧光光度法测定饲料中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。 本标准适用于饲料中配合、浓缩饲料和单一饲料中黄曲霉毒素的测定。 免疫亲和层析净化一荧光光度法测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量检出限为1μg/kg 方法原理 试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水将免疫亲和柱上杂质除去.以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)总量。 试剂和溶液 除非另有规定，仅使用分析纯试剂、超纯水 甲醇(CH30H):色谱纯。 甲醇一水(7+3):取70 ml甲醇加30 ml水。 甲醇一水(8+2):取80 ml甲醇加20 ml水。 氯化钠(NaCl) 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 。 磷酸二氢钾(KH2PO4) 氯化钾(KCl) 溴溶液储备液(0.01%):称取适量溴，溶于水，配成0.01%的储备液，4℃避光保存。 溴溶液工作液(0.002%):取10ml 0.01%的溴溶液加入40ml水混匀，于棕色瓶中保存备用。需每次使用前配制。 二水硫酸奎宁(C20H24N2O2·H2SO4·2H20), 硫酸溶液(0.05mol/L):取2.8ml浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000ml. 荧光光度计校准溶液:称取3.40g 硫酸奎宁(C20H24N2O2·H2SO4·2H20)用0.05mol/L硫酸溶液稀释至100 mL，此溶液荧光光度计读数相当于20 μs/L黄曲霉毒素标准溶液。 仪器和设备 实验室常规仪器、设备及下列各项。 分析天平：0.01g 荧光光度计。 高速均质器.18000r/min--22000r/min 黄曲霉毒素免疫亲和柱。 玻璃纤维滤纸:直径11cm，孔径1.5μm. 玻璃注射器:10ml,20ml。 玻璃试管:直径12mm，长75mm，无荧光特性。 空气压力泵。 移液管：1、15mL。 分析步骤 提取 准确称取经过磨细(粒度小于2mm)的试样25.0g于250ml具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及甲醇一水(7+3)至125.0ml(V1)，以均质器高速搅拌提取2 min。定量滤纸过滤，准确移取15.00 ml(V2)滤液并加入30.0ml(V3)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清，备用。 净化 将免疫亲和柱连接于20.0 ml玻璃注射器下。准确移取15.00 ml(V4)样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6 ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱，抽干。以10 ml水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，抽干。准确加入1.00 ml(V)色谱级甲醇洗脱，流速为1ml/min～2 ml/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。 荧光光度计校准 在激发波长360nm，发射波长450nm 条件下，以0.05m ol/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0.0μg/L;以荧光光度计校准溶液(2.2.12)调节荧光光度计的读数值为20.0 μg/L。 样液测定 取上述净化后的甲醇洗脱液加入1.00ml 0.002%溴溶液，混匀，静置1min，按2.4.3.1条件进行 操作，于荧光光度计中读取样液中黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)的浓度c(μg/L)。 测定 空白试验 用水代替试样，按2.4.1--2.4.3 步骤做空白试验。 结果计算 样品中黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)的含量(X)以微克每千克表示，按式(1)计算: …………………………(1) 其中 式中: X — 样品中黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)含量，单位为微克每千克（μg/kg), c1— 试样中黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)的含量，单位为微克每升(μg/L) ; c0— 空白试验黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)的含量，单位为微克每升（μg/L); V— 最终甲醇洗脱液体积，单