免疫蛋白印迹个人整理2011-6-22.docVIP

Western印迹法 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列 的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋 白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混 合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转 移装置、多用脱色摇床、水浴锅。 试剂：RIPA剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、5％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、5XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、显影液、定影液、抗体(一抗、二抗)、化学发光试剂。 杂品与耗材：各种规格的枪头、离心管（0.5ml、1.5ml）和加样器（0.5-10微升、20-200微升、100-1000微升）；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，滤纸，密封袋，洗衣粉。 试剂配制： （一）母液 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌 后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml 8.0 约10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇 100ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。 10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，4℃保存，保存时间为1到2周。AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可） 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 30％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g 甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g 超纯水至 100ml 37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 【储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤】 20％Tween20 Tween20 20ml 蒸馏水至 100ml 混匀后4℃保存。 （二）使用液 RIPA裂解液 1 M Tris-HCl pH 8.0 2.5ml NaCl 0.438g TritonX－100 0.5ml EDTA 0.0146g 10% SDS 0.5ml 10%脱氧胆酸钠 5ml 蒸馏水至 50ml 混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（1ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF100μl）。 G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G250： 100mg 95％乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸馏水至 100