基因工程DNA诱变讲述.ppt

定向进化与自然进化的异同点： 定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。 定向进化使进化朝着人们需要的方向发展。 Kunkel 法过程包括：????① 当目标 DNA 插入 phagemid 载体并进入 E. coli CJ236 后。????② 由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代了胸腺嘧啶）。????③ M13K07 辅助下，产生带U的ssDNA 。????④ 分离ssDNA，与引入突变的 Oligo 复性。????⑤ 在 T7 DNA polymerase 和T7 DNA ligase 作用下，以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链。????⑥ 感染 dut+ ung+ E. coli　MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了突变位点的子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。 （二）位点选择诱变，又叫抗生素抗性回复突变法 （altered sites in vitro mutagenesis） 使用了2个引物，一个含有突变位点，另一个是选择性引物，用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因。 质粒含有一个突变的Amp抗性基因(不能抗Amp) 将目标DNA克隆到载体中 转化大肠杆菌，提取阳性重组质粒，变性后与两个引物退火 在dNTPs存在时，T4 DNA聚合酶合成新链，用T4 DNA连接酶环化 转化大肠杆菌，在含Amp的培养基上筛选，长出的菌落提质粒，鉴定后送测序 四、PCR介导的定点诱变 优点： 回收率高； 不需ssDNA； 高温降低模板二级结构； 同一试管反应。 * * 第十章 DNA诱变 突变是研究基因结构与功能的最基本手段。 经典方法：分离自发突变体，或用物理、化学因子处理活体来获得突变，再根据突变体的表型，采用遗传学方法鉴定相应基因。 体外诱变：在试管中对DNA进行诱变，改变其核苷酸序列，从而获得突变基因。 用于基因工程、蛋白质工程等研究。 第一节 随机诱变 体外随机诱变：指随机地在克隆化DNA中引入碱基突变。 特点：没有针对性，随机引入突变； 方法：易错PCR 、盒式诱变、增变菌株、化学诱变； 用途：改变基因的编码区，使得蛋白质的氨基酸序列发生改变。 一、易错PCR (error-prone PCR) 概念：在PCR反应中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，得到随机突变的DNA群体，再用载体克隆突变基因 。 易错PCR采用的方法： 增加MgCl2浓度到7mM，稳定非互补的碱基配对； 加入0.5mM的MnCl2，降低pol对模板的特异性； pol量加到5U，促使在错配碱基处继续延伸； 限定4种碱基中的一种，通常为正常浓度的1-10%，在缺乏正确核苷酸时，DNA聚合酶经短暂停顿后，会插入另外3种核苷酸的一种； 3种为正常浓度的正常碱基，第四种为次黄嘌呤dITP（可与C、T、A配对）； dCTP和dTTP的浓度加到1mM，促进错误掺入； 使用突变DNA聚合酶，如Mutazyme。 二、盒式诱变 盒式取代诱变 混合寡核苷酸诱变 盒式取代诱变 种类 盒式取代诱变：从载体中切除特定的dsDNA片段，用突变的DNA片段取代。 混合寡核苷酸诱变 混合寡核苷酸诱变：在人工合成DNA链的过程中，随机引入突变的碱基，得到混合的双链DNA的过程。 三、增变菌株的诱变作用 概念：与DNA错配修复和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率升高，这样的菌株叫增变菌株（mutator strain）。 四、化学诱变 用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的DNA群体克隆到合适的载体中，构建成一个重组突变体库。  这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。如：5-溴尿嘧啶（BU） 为胸腺嘧啶（T）的类似物2-氨基嘌呤（AP） 为腺嘌呤（A）的类似物马来酰肼（MH） 为尿嘧啶（U）的异构体 核酸碱基类似物 第二节 定向诱变（定向进化） 定向进化：一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变，最终获得满足人们需要的性能改良的蛋白质。 是一种依赖序列同源性的DNA体外重组技术。 又称为试管进化、有性PCR (sexual PCR)、分子育种PCR (molecular breeding PCR)。 优点：可以将大量有益突变快速组合，加速产生DNA序列多样性。 使进化从以往的“突变—选择”模式变为与自然进化更为相似的“突变—重组—选择”模式。 定向进化的原理 动力不同：保守突变 非保守取代； 方向不同：适应突变的积累 定向突变的积累